Mikrokärnanalys på kryokonserverat helblod

Ända sedan upptäckten har användningen av joniserande strålning (IR) varit föremål för debatt bland forskare på grund av dess negativa effekter på levande varelser. Den skadliga effekten manifesteras vanligtvis av DNA-skador som dubbelsträngade brott (DSB), och misslyckandet med att reparera dessa DSB leder till kromosomavvikelser och mutationer, vilket är viktiga kännetecken för cancer ^1,2. Sådana kromosomavvikelser kan undersökas med cytogena analyser, t.ex. CBMN-testet (cytokinesis-block micronucleus). Mikrokärnor är eftersläpande kromosomfragment som inte kan inkorporeras i dotterkärnor och därför lämnas kvar under mitosen.

CBMN är en vanlig, tillförlitlig cytogenetisk teknik för att bedöma kromosomskador hos individer som exponerats för joniserande strålning in vivo eller in vitro. Antingen färskt helblod eller isolerade mononukleära celler (PBMC) i perifert blod kan användas i CBMN-analysen. Färskt helblod är mestadels det biologiska materialet eftersom isolering och bearbetning av PBMC kan vara tidskrävande och åtföljs av en förlust av serumplasma som fungerar som det stödjande mediet för cellöverlevnad och tillväxt. För att uppnå ett bra utbyte av binukleära celler bör färskt helblod bearbetas omedelbart efter insamlingen. Behovet av omedelbar bearbetning kan dock vara logistiskt utmanande under tidspress. Dessutom, när många prover är tänkta att tas under en längre period eller samlas in på platser utanför bearbetningscentren, kan lagring av färska blodprover vara en begränsande faktor ^3,4.

Vidare, för att möjliggöra upprepad MN-analys hos samma individ/patient, skulle frysning av blodprover vara fördelaktigt. Ett sätt att lagra lymfocyter för senare applicering av CBMN-analysen är genom att frysa isolerade PBMC ^5,6. Denna teknik kräver dock flera bearbetningssteg innan PBMC:erna kan frysas. Därför skulle kryokonservering av helblod utgöra ett enkelt och tidseffektivt alternativ till kryokonservering av isolerade PBMC. Det finns inte mycket information om användningen av fryst helblod för cytogenetiska analyser eller analyser som kräver proliferation av lymfocyter. Endast en artikel rapporterar användningen av kryokonserverat helblod för metafasanalys⁷.

Eftersom kryokonservering av helblod skulle erbjuda många fördelar inom området biomonitorering, biodosimetri och bedömning av strålkänslighet, optimerade vår grupp ett kryokonserveringsprotokoll för helblod som möjliggör tillämpning av CBMN-analysen⁸. Vi visade att lymfocyter som finns i kryokonserverade helblodskulturer behåller sin genomiska integritet och proliferationskapacitet i minst 1 år. I denna metodartikel beskriver vi i detalj kryokonserveringsproceduren och CBMN-analysprotokollet, som optimerades av Beyls et ^al.8, och rapporterar resultat som erhållits för frysta blodprover från 30 friska individer. För CBMN-analysen bestrålades blodkulturerna in vitro med doser på 0,5, 1 och 2 Gy för att bedöma MN-svaret i lymfocyter från kryokonserverade helblodsprover.

För denna studie samlades blodprover in genom venpunktion från 30 friska donatorer i åldrarna 17 till 65 år. MN-data från 20 donatorer återanvändes från Beyls et ^al.8 Insamlingen av blodproverna sker i enlighet med riktlinjerna från den etiska kommittén vid Universitetssjukhuset i Gent (registreringsnummer:2019/1565), Belgien. Skriftligt informerat samtycke inhämtades från alla deltagare. Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material och reagenser som används i detta protokoll.

1. Insamling av blodprov

1. Innan du börjar, se till att skriftligt informerat samtycke från deltagarna finns tillgängligt och att etiska riktlinjer följs på rätt sätt.
2. Samla blod i Li-heparinrör och förvara i rumstemperatur tills det är klart för bearbetning för kryokonservering.

2. Kryokonservering av helblod

OBS: Alla steg fram till cellskörd utförs aseptiskt i sterilt laminärt luftflöde.

1. För att kryokonservera 1 ml blod, gör 1 ml frysmedium genom att blanda 800 μL Fetal Calf Serum (FCS) och 200 μL dimetylsulfoxid (DMSO).
   OBS: Frysmediet bereds i en volym som är lika med de blodprover som behöver frysas.
2. För kryokonservering av helblod, överför blodprovet från det hepariniserade röret till 15 eller 50 ml centrifugrör
   OBS: Rörets kapacitet beror på blodvolymen.
3. Virvla blodet med låg hastighet med kontinuerlig men droppvis tillsats av en lika stor volym frysmedium.
4. Överför 2 ml blodfryst blandning till kryovialer (2 ml) där varje alikvot har 1 ml blodprov blandat med 1 ml frysblandning.
5. Stegvis gradvis frysning
   1. Överför kryovialer till en kryobox som innehåller isopropanol och ställ i frysen (-80 °C) över natten.
   2. Överför kryovialerna till flytande kväve för långvarig användning.

3. Upptining av kryokonserverat blod

OBS: För att begränsa den totala tiden för upptiningsprocessen bör högst 8 kryovialer (2 ml vardera) hanteras åt gången.

1. Förberedelse
   1. Värm 200 ml steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) till 37 °C innan blodet tinas.
   2. Bered en arbetslösning av det erforderliga odlingsmediet under sterila förhållanden. Se till att mediet per odling innehåller 1,6 ml komplett medium: Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) media kompletterat med penicillin/streptomycin (0,5 %), 0,2 ml FCS, 20 μL natriumpyruvat och 2 μL β-merkaptoetanol.
      OBS: Eftersom ett betydande antal blodkroppar kan gå förlorade vid upptining, odlas det tinade blodet i små brunnar som 24-brunnars plattor med en total volym på 2 ml. En multibrunnsplatta per dos används.
   3. För varje odlingsbrunn, ange donatorkoden och A/B på locket tillsammans med datum och dos, enligt förslaget nedan (figur 1).

Figur 1: Föreslagen layout av en 24-hålsplatta för odling av helblod för mikrokärnanalysen. Märk brunnarna och ange donatorkoderna på lämpliga ställen på locket. För varje patientprov bör dubbla brunnar ligga intill varandra. Observera att det är en suggestiv layout för en 10 x 10 kollimator och kan ändras beroende på storleken på kollimatorn eller proverna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

2. Steg för upptining och odling av helblod
   1. Värm vattenbadet till 37 °C.
   2. Ta ut de nödvändiga kryovialerna från det flytande kvävet (antalet beror på kraven, t.ex. antalet doser).
      OBS: En kryovial innehåller 1 ml blod och 1 ml frysmedium. Därför kan två kulturer ställas in med blod från en kryovial.
   3. Tina kryovialerna delvis i det varma vattenbadet (tills små iskristaller fortfarande syns).
   4. Ta ut injektionsflaskorna ur vattenbadet och rengör utsidan av injektionsflaskorna med sterilt silkespapper.
   5. Öppna injektionsflaskorna mycket långsamt i en steril laminär luftflödeshuv för att förhindra att luftbubblor som bildas inuti rören rinner ut.
   6. Blanda innehållet i varje injektionsflaska på nytt och överför det individuellt till ett 15 ml koniskt centrifugrör (1 rör per injektionsflaska).
   7. Tillsätt droppvis 1 ml varm (37 °C) PBS till respektive rör samtidigt som du försiktigt snurrar röret. Återsuspendera med en P1000-pipett.
   8. För spädning och jämn tvätt, tillsätt droppvis 7 ml förvärmd PBS (37 °C) och återblanda med en P1000-pipett.
   9. Centrifugera blodet i 8 minuter vid 180 × g (med inställning vid acceleration 1, broms 1) vid rumstemperatur.
   10. Under detta väntesteg fylls de tomma brunnarna (andra än den där cellerna kommer att odlas) med 500 μL PBS.
   11. Sätt tillbaka brunnsplattorna i inkubatorn för att förvärma.
   12. När centrifugeringen är klar, ta försiktigt bort supernatanten och lämna kvar cirka 1 ml för att undvika att störa cellpelleten.
   13. Återsuspendera pelleten i den återstående supernatanten med en P1000-pipett.
   14. Tillsätt droppvis 8 ml varm PBS (37 °C) i respektive rör samtidigt som du försiktigt snurrar rören. Blanda sedan om med en P1000-pipett.
   15. Centrifugera det återblandade blodet i 8 minuter vid 180 × g (med inställning vid acceleration 9, broms 9).
   16. Under detta väntesteg överförs 200 μL odlingsmedium till var och en av de markerade brunnarna.
   17. Förvara plattorna i inkubatorn så att de håller en temperatur på 37 °C.
   18. Efter centrifugeringen avlägsnas supernatanten i en kontinuerlig rörelse (för att undvika att den lösa cellpelleten störs), men cirka 80 μl av supernatanten lämnas kvar.
   19. Tillsätt 280 μl FCS (rumstemperatur) till pelleten och återsuspendera (till en total volym på 360 μL).
   20. Överför 180 μl av cellsuspensionen till varje brunn och återsuspendera (= 0,5 ml "blod"/odling). Den totala volymen i varje brunn är nu 380 μL, vilket resulterar i ett 2 mm mellanskikt.
   21. Inkubera plattorna i en CO₂ -inkubator vid 37 °C i minst 10 minuter före bestrålning.

4. G0 MN-analys

1. Ta ut plattorna ur inkubatorn och bestråla cellkulturen med erforderliga doser såsom 0,5, 1 och 2 Gy röntgenstrålar (220 kV, 13 mA, 0,15 mm Cu) vid rumstemperatur. Använd skenbestrålade prover som kontroller för att identifiera spontana MN-utbyten.
2. Tillsätt omedelbart efter bestrålningen 1,62 ml odlingsmedium (37 °C) till varje brunn.
3. För att stimulera celldelningen i T-lymfocyter, tillsätt 40 μl fytohemagglutinin (PHA) till varje brunn och återsuspendera ordentligt.
4. Sätt tillbaka plattorna i inkubatorn (5 % CO₂, 37 °C).
   OBS: Detta kommer att vara starttiden för analysen.
5. Blockera cytokinesen 23 timmar efter stimulering genom att tillsätta 8 μl cytochalasin B (6 μg/ml) per brunn och återblanda på rätt sätt.
6. Skörda cellkulturerna 70 timmar efter stimulering/odlingstid. Återsuspendera och överför cellerna till ett 15 ml rör. Skölj varje brunn med 2 ml PBS och tillsätt denna PBS till respektive 15 ml rör.
7. Centrifugera rören i 8 minuter vid 180 × g, vid rumstemperatur.
8. Kassera supernatanten men lämna cirka 500 μl över pelleten.
9. Vred pelleten (på full hastighet) och tillsätt långsamt 2 ml kall kaliumklorid (KCl, 4 °C) under virvlning.
10. Centrifugera omedelbart cellerna vid 180 × g i 8 minuter.
11. Kassera supernatanten och lämna kvar cirka 500 μl av supernatanten.
12. Virvla pelleten (på full hastighet) och tillsätt långsamt droppvis 2 ml kallt fixeringsmedel 1 (metanol/ättiksyra/ringerlösning i förhållandet 4:1:5) under virvlning.
13. Låt provrören stå över natten vid 4 °C (minst 12 timmar och högst 96 timmar).
14. Centrifugera i 8 minuter vid 180 × g.
15. Kassera supernatanten.
16. Virvla pelleten (på full hastighet) och tillsätt långsamt droppvis 2 ml kallt fixeringsmedel 2 (metanol/ättiksyra i förhållandet 4:1) medan du virvlar.
17. Centrifugera i 8 minuter vid 180 × g.
18. Kassera supernatanten.
19. Vred pelleten (på full hastighet) och tillsätt sedan långsamt (droppvis), medan du virvlar, 2 ml kallt fixeringsmedel 2 till pelleten.
20. Låt provrören stå vid 4 °C (minst 12 timmar och högst 96 timmar).
21. Rengör objektglasen med isopropanol och märk dem ordentligt.
    OBS: Använd tryckta klistermärken för att märka eftersom markörbläcket lätt torkas bort under bearbetningen.
22. Centrifugera provrören i 8 minuter vid 180 × g.
23. Överför supernatanten till ett annat rör för att koncentrera cellerna efter pelletens storlek.
24. Virvla pelleten.
25. Släpp 40 μL av de fasta cellerna på ett torrt och rent objektglas.
26. Låt objektglasen torka i rumstemperatur. Förvara objektglasen i en låda eller fläck omedelbart för observation.

5. Färgning av akridinorange (AO)

1. Sänk ner objektglasen i AO-fläck i 1 minut, följt av en snabb tvätt i det destillerade vattnet, och placera sedan objektglasen i fosfatbuffert (pH 6.8) i 1 minut.
2. Ta ut objektglasen ur buffertlösningen och torka glasets baksida med rent silkespapper och lägg objektglasen på ett rent silkespapper.
3. Släpp 20 μL av fosfatbufferten ovanpå objektglaset och täck det försiktigt med ett rent täckglas, undvik luftbubblor.
4. Försegla dessa objektglas med silikoncement.
   OBS: Eftersom AO är ljuskänsligt och bleknar med tiden, för en fin kontrast och fluorescens, rekommenderas skårning av objektglasen inom 5 dagar efter färgning. Förvara alltid objektglasen i ett kylrum (4 °C) när de inte undersöks.

6. Poängsättning av färgade bilder

1. Placera objektglaset under ett fluorescensmikroskop och undersök 1 000 binukleära celler (BN). Räkna manuellt MN, som är en av de sex biomarkörerna för toxicitet. För att göra det, låt två oberoende bedömare undersöka 500 BN-celler/bild under samma förstoring.
   OBS: Följande är några höjdpunkter i poängkriterierna, som rekommenderas av Fenech för att poängsätta de färgade bilderna⁹
   1. Välj en BN-cell genom att leta efter fint rundade celler med intakt cytoplasma, med två väl urskiljbara kärnor av ungefär samma storlek, regelbunden form och färgningsmönster. Se till att cytoplasman i BN-cellen kan särskiljas från cytoplasman i den intilliggande cellen.
   2. Poängsätt ett MN och notera att det är morfologiskt identiskt med men mindre än huvudkärnorna; även den största MN kan inte vara mer än 1/3 av diametern på huvudkärnorna. Poängsätt ett MN endast om det inte vidrör huvudkärnorna eller åtminstone om den mikronukleära gränsen kan särskiljas från gränsen för huvudkärnorna.

För att validera protokollets reproducerbarhet utförde vi MN-analysen på kryokonserverade blodprover från 30 friska frivilliga i åldrarna 17 till 65 år. Medelåldern i gruppen är 35 år. Kryokonserveringstiden varierade från 1 vecka till 154 veckor. Efter att ha exponerat helblodscellkulturen för olika stråldoser (0,5, 1 och 2 Gy) undersöktes mikrokärnutbytet i 1 000 BN-celler i mikroskop. Fint rundade binukleära celler (som kan ses i figur 2) indikerar en framgångsrik hämtning av friska livskraftiga celler från kryokonserverade helblodsprover. Värt att notera är att lymfocyternas strålningsrespons förblev stabil efter långtidsförvaring vid ultralåga temperaturer (flytande kväve). Denna observation är i linje med den respons som förväntas från färska blodprover.

Figur 2: Mikrokärnor som observerats i binukleära celler som hämtats från ett fryst helblodsprov som kryokonserverades för 1 år sedan. (A) Förstoring 200x, (B) Förstoring 400x; Pilar som pekar mot MN. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Med ökade strålningsdoser (0,5, 1 och 2 Gy) observerades en linjär-kvadratisk ökning av utbytet av mikrokärnor (tabell 1 och figur 3). MN-utbytena i skenbestrålade kontrollprover (0 Gy) representerar bakgrundsavkastningen av MN som huvudsakligen är resultatet av eftersläpande kromosomer.

Tabell 1: Variationsintervall och variationskoefficient tillsammans med genomsnittlig MN-avkastning, som observerats i kryokonserverade helblodsprover från 30 friska givare, vilket tyder på interindividuell variabilitet. Förkortningar: CV = variationskoefficient; SD = standardavvikelse.

Figur 3: Mikrokärnor som observerats i kontrollerade och bestrålade kryokonserverade helblodsprover från 30 givare. Kryokonserveringsperioderna varierade från 1 vecka till 154 veckor. Punktdiagrammet visar enskilda värden. Linjer i kluster representerar medelvärdet ± SD för gruppen. Förkortningar: MN = mikrokärnor; BN = binukleär. Klicka här för att se en större version av denna figur.

För att undersöka den interindividuella variationen i MN-utbytet för personer beräknades variationskoefficienten (CV) (se tabell 1). För strålningsinducerad MN erhölls en CV < 25 % för alla doser (0,5, 1 och 2 Gy), vilket indikerar god reproducerbarhet av det modifierade protokollet.

Det modifierade protokollet för applicering av CBMN-analysen är ett relativt enkelt och bekvämt sätt att lagra blodprover i bulk. Proceduren beskriver alla små men viktiga detaljer som måste tas om hand under kryokonservering och CBMN-analysen. Andra labbprotokoll använder normalt 10 % DMSO i frysblandningen, medan vår frysblandning innehåller 20 % DMSO tillsammans med 80 % FCS⁷. Eftersom denna frysblandning tillsätts i lika stora volymer till helblodsprovet är den slutliga koncentrationen också 10 % DMSO. För att förbättra cellöverlevnaden och stimulera celldelningen tillsätter vi 1 % natriumpyruvat och 0,1 % beta-merkaptoetanol till det kompletta odlingsmediet (cRPMI). Detta är i enlighet med det cellodlingsprotokoll som fastställts av vår forskargrupp ^6,8.

Även om problemet med cellklumpar under upptining inte kunde lösas helt i detta protokoll, var cellsegregeringen bättre än de andra konventionella protokollen. Istället för konsekvent, abrupt tillsats av odlingsmedia för att återvinna celler efter upptining, fick vi bättre resultat när förvärmd PBS (37 °C) tillsattes droppvis under tvättstegen. Denna förbättring hjälper till att minska cellulär stress och minimerar klumpar med en bevisad hög återhämtning av celler. Dessutom kunde ingen tydlig skillnad i cellviabilitet observeras när PBS användes över RPMI. Det har validerats av gruppen att längden på kryokonserveringsperioden (upp till 1 år) inte kommer att påverka MN-avkastningen, både i bestrålade och icke-bestrålade prover ^6,8. Studier tyder på att god cellviabilitet och proliferation av PBMC kan uppnås med gradvis frysning vid låga temperaturer (flytande kväve), följt av gradvis tillsats av förvärmt medium under upptining ^10,11. Forskare har visat att subpopulationerna av T-lymfocyter i tinat helblod är jämförbara med de som observerats i tinat PBMC¹². Vidare är det bevisat att cellsubtyper som återvunnits från kryokonserverade helblodsprover liknar de som observerats i färska helblodsprover^13,14.

Om vi undersöker de indikativa resultaten som erhållits i rapporten ser vi att den linjära kvadratiska ökningen med dos (Figur 3) överensstämmer med andra litteraturrapporter om linjär energiöverföring (LET)-inducerade mikrokärnor^15,16. Variationen i MN-avkastning som observerats i de kryokonserverade helblodsproverna (tabell 1) ligger inom intervallet med den som rapporterats för färska helblodsodlingar ^8,17,18. Protokollet som beskrivs i detalj här validerades på färskt och kryokonserverat helblod från 20 friska frivilliga⁸. Det nukleära delningsindexet (NDI), som är en viktig parameter för cellproliferation som observerades i den rapporten⁸, överensstämde med det som föreslogs för färskt helblod^19,20. Sammantaget ger detta optimerade protokoll för kryokonservering av helblod och modifierad mikrokärnanalys ett bättre cellutbyte och därför rekommenderas anpassning av detta protokoll för strålkänslighetsbedömningar. Eftersom protokollets reproducerbarhet redan har validerats⁸, föreslås det att det kan tillämpas i storskaliga studier och multicenterstudier.