Her præsenterer vi en optimeret protokol for cytokinesis-blokmikronukleusanalysen på kryopræserverede fuldblodsprøver. Denne optimerede metode til kryopræservering af fuldblod til mikronukleusanalyse er en pålidelig teknik til storskala prøveudtagning og multicenterundersøgelser og kan også bruges til andre blodrelaterede assays.
In vitro cytokinesis-blok mikronucleus (CBMN) assay er en meget anvendt teknik i radiobiologisk forskning, biologisk dosimetri, genotoksicitetsundersøgelser og in vitro radiosensitivitetstest. Denne cytogenetiske metode er baseret på påvisning af mikrokerner i binucleerede celler som følge af kromosomale fragmenter, der hænger under celledeling. Friske fuldblodsprøver er den mest foretrukne prøvetype til CBMN-analysen. Ulemperne ved at arbejde med friske blodprøver omfatter imidlertid øjeblikkelig behandling efter blodindsamling og det begrænsede antal gentagne analyser, der kan udføres uden ekstra blodprøvetagning.
Da behovet for friske blodprøver kan være logistisk udfordrende, vil CBMN-analyse af kryopræserverede fuldblodsprøver være en stor fordel, især i store patientundersøgelser. Dette papir beskriver en protokol til frysning af fuldblodsprøver og til at udføre CBMN-analysen på disse frosne blodprøver. Blodprøver fra raske frivillige er blevet frosset og optøet på forskellige tidspunkter og derefter udsat for en modificeret mikronukleusanalyseprotokol. Resultaterne viser, at denne optimerede procedure gør det muligt at udføre CBMN-analysen på frosne blodprøver. Den beskrevne kryopræserveringsprotokol kan også være meget nyttig til andre cytogenetiske assays og en række funktionelle assays, der kræver prolifererende lymfocytter.
Lige siden opdagelsen har brugen af ioniserende stråling (IR) været et spørgsmål om debat blandt forskere på grund af dets negative virkninger på levende væsener. Den skadelige virkning manifesteres normalt af DNA-skader såsom dobbeltstrengede brud (DSB’er), og manglende reparation af disse DSB’er fører til kromosomafvigelser og mutationer, som er vigtige kendetegn ved kræft 1,2. Sådanne kromosomafvigelser kan undersøges ved cytogene assays, såsom cytokinesis-blokmikronukleus-assayet (CBMN). Mikrokerner er forsinkede kromosomale fragmenter, der ikke kan inkorporeres i datterkerner og derfor efterlades under mitose.
CBMN er en almindeligt anvendt, pålidelig cytogenetisk teknik til vurdering af kromosomskader hos personer, der udsættes for in vivo eller in vitro ioniserende stråling. Enten frisk fuldblod eller isolerede mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) kan anvendes i CBMN-assayet. Frisk fuldblod er for det meste det biologiske materiale, der vælges, da isolering og behandling af PBMC’er kan være tidskrævende og ledsages af et tab af serumplasma, der fungerer som støttemedium for celleoverlevelse og vækst. For at opnå et godt binucleated celleudbytte skal frisk fuldblod behandles umiddelbart efter indsamling. Behovet for øjeblikkelig behandling kan dog være logistisk udfordrende under tidspres. Når mange prøver skal erhverves over en længere periode eller indsamles på steder væk fra behandlingscentrene, kan opbevaring af friske blodprøver desuden være en begrænsende faktor 3,4.
For at muliggøre gentagen MN-analyse hos samme individ/patient vil nedfrysning af blodprøver desuden være gavnlig. En måde at opbevare lymfocytter til senere anvendelse af CBMN-analysen er ved at fryse isolerede PBMC’er 5,6. Denne teknik kræver dog flere behandlingstrin, før PBMC’erne kan fryses. Kryopræservering af fuldblod vil derfor udgøre et enkelt og tidseffektivt alternativ til kryopræservering af isolerede PBMC’er. Der foreligger kun få oplysninger om anvendelsen af frosset fuldblod til cytogenetiske assays eller assays, der kræver proliferation af lymfocytter. Kun én artikel rapporterer om brugen af kryopræserveret fuldblod til metafaseanalyse7.
Da kryopræservering af fuldblod ville give mange fordele inden for bioovervågning, biodosimetri og radiosensitivitetsvurdering, optimerede vores gruppe en kryopræserveringsprotokol for fuldblod, der tillader anvendelse af CBMN-assay8. Vi påviste, at lymfocytter, der er til stede i kryopræserverede fuldblodskulturer, bevarer deres genomiske integritet og spredningskapacitet i mindst 1 år. I dette metodepapir beskriver vi detaljeret kryopræserveringsproceduren og CBMN-assayprotokollen, som blev optimeret af Beyls et al.8, og rapporterer fund opnået for frosne blodprøver på 30 raske individer. Til CBMN-analysen blev blodkulturerne bestrålet in vitro med doser på 0,5, 1 og 2 Gy for at vurdere MN-responset i lymfocytter af kryopræserverede fuldblodprøver.
Den modificerede protokol til anvendelse af CBMN-analysen er en relativt nem og bekvem måde at opbevare blodprøver i løs vægt på. Proceduren skitserer alle de små, men vigtige detaljer, der skal tages hånd om under kryopræservering og CBMN-assayet. Andre laboratorieprotokoller bruger normalt 10% DMSO i fryseblandingen, mens vores fryseblanding indeholder 20% DMSO sammen med 80% FCS7. Da denne fryseblanding tilsættes i lige store mængder til hele blodprøven, er den endelige koncentration også 10% DMSO. For at forbedre celleoverlevelsesraten og stimulere celledeling tilføjer vi 1% natriumpyruvat og 0,1% beta-mercaptoethanol til det komplette dyrkningsmedium (cRPMI). Dette er i overensstemmelse med cellekulturprotokollen etableret af vores forskningsgruppe 6,8.
Selvom problemet med celleklumpning under optøning ikke kunne løses fuldstændigt i denne protokol, var celleadskillelse bedre end de andre konventionelle protokoller. I stedet for konsekvent, abrupt tilsætning af dyrkningsmedier for at genvinde celler efter optøning opnåede vi bedre resultater, når forvarmet PBS (37 °C) blev tilsat dråbevis under vasketrinnene. Denne forbedring hjælper med at reducere cellulær stress og minimerer klumpning med en dokumenteret høj genopretning af celler. Desuden kunne der ikke observeres nogen klar forskel i cellelevedygtighed, når PBS blev brugt over RPMI. Gruppen har valideret, at kryopræserveringsperiodens længde (op til 1 år) ikke vil påvirke MN-udbyttet, både i bestrålede og ikke-bestrålede prøver 6,8. Undersøgelser tyder på, at god cellelevedygtighed og spredning af PBMC’er kan opnås ved gradvis frysning ved lave temperaturer (flydende nitrogen) efterfulgt af gradvis tilsætning af forvarmet medium under optøning af10,11. Forskere har vist, at underpopulationerne af T-lymfocytter i optøet fuldblod er sammenlignelige med dem, der observeres i optøede PBMC’er12. Endvidere er det bevist, at celleundertyper genfundet fra kryopræserverede fuldblodsprøver svarer til dem, der observeres i friske fuldblodsprøver13,14.
Hvis vi undersøger de vejledende resultater opnået i rapporten, ser vi, at den lineære kvadratiske stigning med dosis (figur 3) er i overensstemmelse med andre litteraturrapporter om lineær energioverførsel (LET)-inducerede mikrokerner15,16. Variabiliteten i MN-udbytter observeret i de kryopræserverede fuldblodsprøver (tabel 1) ligger på linje med den, der er rapporteret for friske fuldblodsdyrkninger 8,17,18. Den protokol, der er beskrevet detaljeret her, blev valideret på frisk og kryopræserveret fuldblod fra 20 raske frivillige8. Det nukleare delingsindeks (NDI), som er en vigtig parameter for celleproliferation observeret i denne rapport8, var i overensstemmelse med det, der blev foreslået for frisk fuldblod19,20. Samlet set giver denne optimerede protokol for kryopræservering af fuldblod og modificeret mikronukleusanalyse et bedre celleudbytte, og derfor anbefales tilpasning af denne protokol til radiofølsomhedsvurderinger. Da protokollens reproducerbarhed allerede er valideret8, foreslås det at have anvendelighed i store og multicenterundersøgelser.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke L. Pieters, T. Thiron og G. De Smet for deres tekniske support. Vi er taknemmelige for alle de frivillige, der donerede blod til undersøgelsen. Arbejdet blev støttet økonomisk af Forskningsfonden Flandern (FWO) under tilskud (T000118N).
15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188271 | |
24-well cell suspension plate | VWR | 734-2779 | |
96% alcohol | ChemLab | CL00.1807.2500 | |
Acetic acid | Merck life science | 8,18,75,52,500 | |
Acridine orange | Merck life science | 235474-5g | |
CaCl2 | Merck life science | C5670-100g | |
cover slips | VWR | 631-1365 | 22 x 50 |
Cryobox (Mr.Frosty) | Nalgene, Sigma Aldrich | ||
Cryovials 2ml | Novolab | A04573 | |
Cytochalsin B | Merck life science | C6762-10 | 10 mg |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Merck life science | D4540-500ml | |
Fetal calf serum (FCS) | Thermo Fischer scientific | 10270-106 | |
Fixative 1 | Methanol/acetic acid/ringer in a ratio of 4:1:5 | ||
Fixative 2 | Methanol/acetic acid in a ratio of 4:1 | ||
GURR buffer | Thermo Fischer scientific | 10582013 | phosphate buffer (pH 6.8) |
KCl | Merck life science | 1,04,93,60,250 | 75 mM |
KH2PO4 | Merck life science | 1,04,87,30,250 | |
Li-heparin tubes | BD Life sciences | 367526-LH170 I.U. | BD Vacutainer |
Methanol | fisher scinetific | M/4000/17 | |
Na2HPO2 | Merck life science | 10,65,80,500 | |
NaCl | Merck life science | S7653-1kg | |
Object slides | VWR | MENZAA00000112E04 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer scientific | 15140-122 | 10,000 U/mL + 10,000 µg/mL |
Phytohemagglutinin (PHA-M) | Thermo Fischer scientific | 10576-015 | |
Ringer solution | contains NaCl, KCl, CaCl2 dissolved in distilled water | ||
RPMI-1640 | Thermo Fischer scientific | 52400041 | |
Silicon rubber adhesive sealent | collall | CF-100 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fischer scientific | 11360039 | |
Sterile warm PBS (37 °C) | contains NaCl, Na2HPO2, KH2PO4 dissolved in distilled water | ||
β-mercaptoethanol | Thermo Fischer scientific | 31350-010 |