冷冻保存全血的微核检测

在这项研究中，通过静脉穿刺收集了 30 名年龄在 17 至 65 岁之间的健康供体的血样。来自 20 名捐献者的 MN 数据从 Beyls 等人的论文中重复使用8 血液 样本的收集符合比利时根特大学医院伦理委员会（注册号：2019/1565）的指南。已获得所有参与者的书面知情同意书。有关本协议中使用的所有材料和试剂的详细信息 ，请参阅材料表 。 1. 采集血样 在开始之前，确保参与者的书面知情同意书可用，并正确遵守道德准则。 将血液收集到Li-肝素管中并在室温下储存，直到准备好进行冷冻保存。 2. 全血的冷冻保存 注意：细胞收获之前的所有步骤都在无菌层流气流中无菌进行。 要冷冻保存 1 mL 血液，通过混合 800 μL 胎牛血清 （FCS） 和 200 μL 二甲基亚砜 （DMSO） 制备 1 mL 冷冻培养基。注意：冷冻培养基的制备体积等于需要冷冻的血液样本。 对于全血的冷冻保存，将血液样本从肝素管转移到 15 或 50 mL 离心管中注意：管子的容量取决于血液的体积。 以低速涡旋血液，连续但 滴加 等体积的冷冻培养基。 将 2 mL 血液冷冻混合物转移到冷冻管 （2 mL） 中，其中每个等分试样有 1 mL 血液样本与 1 mL 冷冻混合物混合。 逐步逐步冻结将冷冻管转移到含有异丙醇的冷冻箱中，并放入冰箱（-80°C）过夜。 将冷冻管转移到液氮中长期使用。 3. 冷冻保存的血液解冻 注意：为了限制解冻过程的总时间，一次最多应处理 8 个冻存管（每个 2 mL）。 制备在解冻血液之前，将200 mL无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）预热至37°C。 在无菌条件下制备所需培养基的工作溶液。确保每次培养的培养基含有 1.6 mL 完全培养基：补充有青霉素/链霉素 （0.5%）、0.2 mL FCS、20 μL 丙酮酸钠和 2 μL β-巯基乙醇的罗斯韦尔公园纪念研究所 （RPMI） 培养基。注意：由于解冻时可能会丢失大量血细胞，因此解冻的血液在总体积为 2 mL 的 24 孔板等小孔中培养。每剂使用一个多孔板。 对于每个培养孔，在盖子上注明供体代码和A / B以及日期和剂量，如下所示（图1）。 图 1：用于培养用于微核测定的全血的 24 孔板的建议布局。 标记孔并在盖子上的适当位置标明供体代码。对于每个患者样本，重复的孔应彼此相邻。请注意，它是 10 x 10 准直器的建议布局，可以根据准直器或样品的大小进行更改。 请点击这里查看此图的较大版本. 解冻和培养全血的步骤将水浴加热至37°C。 从液氮中取出所需的冷冻管（数量取决于剂量等要求）。注意：一个冷冻管含有 1 mL 血液和 1 mL 冷冻培养基。因此，可以用来自一个冷冻卵管的血液建立两个培养物。 在温水浴中部分解冻冷冻管（直到仍然看到小冰晶）。 从水浴中取出小瓶，并用无菌纸巾清洁小瓶的外部。 在无菌层流罩中，非常缓慢地打开小瓶，以防止管内形成的气泡溢出。 重悬每个小瓶的内容物，并将它们单独转移到 15 mL 锥形离心管（每小瓶 1 管）中。 向相应的试管中滴加 1 mL 温热 （37 °C） PBS，同时轻轻旋转试管。用 P1000 移液器重悬。 为了稀释和均匀洗涤，滴加7 mL预热的PBS（37°C），并用P1000移液管重悬。 在室温下以180× g （设置为 加速1，制动1）离心血液8分钟。 在此等待步骤中，用 500 μL PBS 填充空孔（将要培养细胞的孔除外）。 将孔板放回培养箱中预热。 离心完成后，小心地除去上清液，留下约1 mL，以避免干扰细胞沉淀。 用P1000移液管将沉淀重悬于剩余的上清液中。 将8mL温热的PBS（37°C）滴加到相应的试管中，同时轻轻旋转试管。然后，用P1000移液器重悬。 将重悬的血液以180× g 离心8分钟（ 设置为加速度9，制动9）。 在此等待步骤中，将 200 μL 培养基转移到每个标记的孔中。 将板放回培养箱中以保持37°C。 离心后，以连续运动除去上清液（以避免干扰松散的细胞沉淀），但留下约80μL的上清液。 向沉淀中加入 280 μL FCS（室温）并重悬（总体积为 360 μL）。 将 180 μL 细胞悬液转移到每个孔中并重悬（= 0.5 mL “血液”/培养物）。现在，每个孔中的总体积为 380 μL，形成 2 mm 的培养基层。 在辐照前，将板在37°C的CO2 培养箱中孵育至少10分钟。 4. G0 MN测定 从培养箱中取出培养板，并在室温下用所需剂量（例如 0.5、1 和 2 Gy X 射线（220 kV、13 mA、0.15 mm Cu）照射细胞培养物。使用假辐照样品作为对照来鉴定自发的 MN 产量。 辐照后，立即向每个孔中加入1.62mL培养基（37°C）。 为了刺激 T 淋巴细胞中的细胞分裂，向每个孔中加入 40 μL 植物血凝素 （PHA） 并彻底重悬。 将这些板放回培养箱（5%CO 2,37°C）。注意：这将是测定的 开始时间 。 通过每孔加入 8 μL 细胞松弛素 B （6 μg/mL） 在刺激后 23 小时阻断胞质分裂并适当重悬。 在刺激/培养时间后70小时收获细胞培养物。将细胞重悬并转移到 15 mL 试管中。用 2 mL PBS 冲洗每个孔，并将该 PBS 加入相应的 15 mL 试管中。 在室温下以180× g离心管8分钟。 弃去上清液，但在沉淀上留下约500μL。 涡旋沉淀（全速），在涡旋的同时，缓慢滴加2mL冷氯化钾（KCl，4°C）。 立即将细胞以180× g 离心8分钟。 弃去上清液，留下约500μL上清液。 涡旋沉淀（全速），在涡旋的同时，缓慢滴加 2 mL 冷 固定剂 1 （甲醇/乙酸/林格溶液，比例为 4：1：5）。 将样品管在4°C下过夜（最短12小时，最多96小时）。 以180× g离心8分钟。 弃去上清液。 涡旋沉淀（全速），在涡旋的同时，缓慢滴加2mL冷 固定剂2 （甲醇/乙酸，比例为4：1）。 以180× g离心8分钟。 弃去上清液。 涡旋沉淀（全速），然后在涡旋的同时缓慢（滴加）2 mL 冷 固定剂 2 到沉淀中。 将样品管保持在4°C（最短12小时和最多96小时）。 用异丙醇清洁载玻片并正确标记它们。注意： 使用打印的贴纸贴标签，因为记号笔墨水在加工时很容易擦掉。 将样品管以180× g离心8分钟。 将上清液转移到另一个管中，以根据沉淀的大小浓缩细胞。 涡旋颗粒。 将 40 μL 固定细胞滴入干燥干净的载玻片上。 让载玻片在室温下干燥。立即将载玻片存放在盒子或染色剂中以供观察。 5.吖啶橙（AO）染色 将载玻片浸入AO染色剂中1分钟，然后在蒸馏水中快速洗涤，然后将载玻片置于磷酸盐缓冲液（pH 6.8）中1分钟。 从缓冲溶液中取出载玻片，并用干净的薄纸，擦干载玻片的背面，然后将载玻片放在干净的薄纸上。 将 20 μL 磷酸盐缓冲液滴在载玻片顶部，并用干净的盖玻片轻轻盖住，避免气泡。 用硅胶粘合剂密封这些载玻片。注意：由于 AO 对光敏感并且会随着时间的推移而褪色，因此为了获得良好的对比度和荧光，建议在染色后 5 天内对载玻片进行评分。未检查时，始终将载玻片存放在冷藏室（4°C）中。 6. 对染色载玻片进行评分 将载玻片置于荧光显微镜下，检查 1,000 个双核细胞 （BN）。手动计算 MN，MN 是毒性的六种生物标志物之一。为此，请让两名独立的评分员在相同的放大倍率下检查 500 个 BN 细胞/载玻片。注：以下是 Fenech 推荐的评分标准的一些亮点，用于对染色载玻片9 进行评分通过寻找具有完整细胞质的圆形细胞来选择 BN 细胞，这些细胞具有两个大小大致相同、形状规则和染色模式的明显区分的细胞核。确保BN细胞的细胞质与相邻细胞的细胞质可区分。 对 MN 进行评分，注意它在形态上与主核相同但小于主核;即使是最大的MN也不能超过主核直径的1/3。只有当MN不接触主核或至少微核边界与主核边界可区分时，才对MN进行评分。