O Ensaio do Micronúcleo em Sangue Total Criopreservado

Para este estudo, amostras de sangue foram coletadas por punção venosa de 30 doadores saudáveis com idade entre 17 e 65 anos. Os dados de NM de 20 doadores foram reutilizados do artigo de Beyls et al.8 A coleta das amostras de sangue está de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética do Hospital Universitário de Ghent (número de registro:2019/1565), Bélgica. Consentimento informado foi obtido de todos os participantes. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais e reagentes usados neste protocolo. 1. Coleta de amostras de sangue Antes de começar, certifique-se de que o consentimento informado por escrito dos participantes esteja disponível e que as diretrizes éticas sejam seguidas adequadamente. Coletar sangue em tubos de Li-Heparina e armazenar em temperatura ambiente até estar pronto para processamento para criopreservação. 2. Criopreservação de sangue total OBS: Todas as etapas até a colheita das células são realizadas de forma asséptica em fluxo de ar laminar estéril. Para criopreservar 1 mL de sangue, fazer 1 mL de meio de congelamento misturando 800 μL de Soro Fetal de Bezerro (FCS) e 200 μL de dimetilsulfóxido (DMSO).NOTA: O meio de congelamento é preparado em um volume igual às amostras de sangue que precisam ser congeladas. Para criopreservação de sangue total, transferir a amostra de sangue do tubo heparinizado para tubos centrífugos de 15 ou 50 mLNOTA: A capacidade do tubo depende do volume do sangue. Vórtice o sangue a baixa velocidade com adição contínua , mas gota a gota , de um volume igual de meio de congelamento. Transfira 2 ml de mistura de sangue congelado para criópoles (2 ml) onde cada alíquota tem 1 ml de amostra de sangue misturada com 1 ml de mistura congelante. Congelamento gradual gradualTransfira os crióscos para uma criocaixa contendo isopropanol e coloque em um congelador (-80 °C) durante a noite. Transfira os criófrascos para nitrogênio líquido para uso a longo prazo. 3. Descongelamento do sangue criopreservado NOTA: Para limitar o tempo total do processo de descongelamento, um máximo de 8 crióscos (2 mL cada) devem ser manuseados por vez. PreparaçãoPré-aquecer 200 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) a 37 °C antes de descongelar o sangue. Preparar uma solução de trabalho do meio de cultura necessário em condições estéreis. Certifique-se de que o meio por cultura inclua 1,6 mL de meio completo: meio Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com penicilina/estreptomicina (0,5%), 0,2 mL de FCS, 20 μL de piruvato de sódio e 2 μL de β-mercaptoetanol.NOTA: Uma vez que um número significativo de células sanguíneas pode ser perdido durante o descongelamento, o sangue descongelado é cultivado em pequenos poços como placas de 24 poços com um volume total de 2 mL. Uma placa de poço múltiplo por dose é usada. Para cada cultura, indicar o código doador e A/B na tampa, juntamente com a data e dose, conforme sugerido abaixo (Figura 1). Figura 1: Sugestão de disposição de placa de 24 poços para cultura de sangue total para o ensaio do micronúcleo. Marque os poços e indique os códigos dos doadores em locais apropriados na tampa. Para cada amostra de paciente, os poços duplicados devem ser adjacentes uns aos outros. Note que é um layout sugestivo para um colimador 10 x 10 e pode ser alterado de acordo com o tamanho do colimador ou amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Passos para descongelar e cultivar sangue totalAqueça o banho-maria a 37 °C. Retire os criósculos necessários do nitrogênio líquido (o número depende das necessidades, como o número de doses).NOTA: Um criovial contém 1 mL de sangue e 1 mL de meio de congelamento. Portanto, duas culturas podem ser configuradas com sangue de um criovial. Descongelar parcialmente os crióvios no banho de água morna (até que pequenos cristais de gelo ainda sejam vistos). Retire os frascos para injetáveis do banho-maria e limpe o exterior dos frascos com papel de seda estéril. Em um exaustor de fluxo de ar laminar estéril, abra os frascos muito lentamente para evitar que bolhas de ar formadas dentro dos tubos se derramem. Ressuspenda o conteúdo de cada frasco para injetáveis e transfira-o individualmente para um tubo de centrífuga cónica de 15 ml (1 tubo por frasco para injetáveis). Aos respectivos tubos, adicione gota a gota 1 mL de PBS morno (37 °C) enquanto gira suavemente o tubo. Ressuspenda com uma pipeta P1000. Para diluição e lavagem uniforme, adicionar gota a gota 7 mL de PBS pré-aquecido (37 °C) e ressuspender com uma pipeta P1000. Centrifugar o sangue durante 8 minutos a 180 × g (com regulação na aceleração 1, travão 1) à temperatura ambiente. Durante esta etapa de espera, preencha os poços vazios (exceto aquele onde as células serão cultivadas) com 500 μL de PBS. Coloque as placas de poço de volta na incubadora para pré-aquecer. Uma vez concluída a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante, deixando para trás aproximadamente 1 mL para evitar perturbar o pellet celular. Ressuspender o pellet no sobrenadante restante com uma pipeta P1000. Adicionar gota a gota 8 mL de PBS quente (37 °C) nos respectivos tubos enquanto gira suavemente os tubos. Depois, ressuspenda com uma pipeta P1000. Centrifugar o sangue ressuspendido por 8 min a 180 × g (com ajuste na aceleração 9, freio 9). Durante essa etapa de espera, transferir 200 μL de meio de cultura para cada um dos poços marcados. Mantenha as placas de volta na incubadora para permanecer a 37 °C. Após a centrifugação, remova o sobrenadante em um movimento contínuo (para evitar perturbar a pastilha de células soltas), mas deixe para trás aproximadamente 80 μL do sobrenadante. Ao pellet, adicionar 280 μL de FCS (temperatura ambiente) e ressuspender (para um volume total de 360 μL). Transferir 180 μL da suspensão celular para cada poço e ressuspender (= 0,5 mL de “sangue”/cultura). O volume total em cada poço é agora de 380 μL, resultando em uma camada média de 2 mm. Incubar as placas numa incubadora de CO2 a 37 °C durante, pelo menos, 10 minutos antes da irradiação. 4. Ensaio G0 MN Retire as placas da incubadora e irradie a cultura celular com as doses necessárias, como raios X de 0,5, 1 e 2 Gy (220 kV, 13 mA, 0,15 mm) à temperatura ambiente. Use amostras simuladas irradiadas como controle para identificar rendimentos espontâneos de MN. Imediatamente após a irradiação, adicionar 1,62 mL de meio de cultura (37 °C) a cada poço. Para estimular a divisão celular em linfócitos T, adicione 40 μL de Fitohemaglutinina (PHA) a cada poço e ressuspenda completamente. Coloque estas placas de volta na incubadora (5% CO2, 37 °C).NOTA: Esta será a hora de início do ensaio. Bloquear a citocinese 23 h após a estimulação adicionando 8 μL de citocalasina B (6 μg/mL) por poço e ressuspender adequadamente. Colher as culturas celulares 70 h após a estimulação/tempo de cultivo. Ressuspender e transferir as células para um tubo de 15 mL. Enxaguar cada poço com 2 mL de PBS e adicionar este PBS ao respectivo tubo de 15 mL. Centrifugar os tubos durante 8 min a 180 × g, à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante, mas deixe aproximadamente 500 μL sobre o pellet. Vórtice o pellet (a toda velocidade) e, durante o vórtice, adicione lentamente 2 mL de cloreto de potássio frio (KCl, 4 °C). Centrifugar imediatamente as células a 180 × g durante 8 min. Descarte o sobrenadante, deixando aproximadamente 500 μL do sobrenadante. Vórtice o pellet (a toda velocidade) e, durante o vórtice, adicione lentamente 2 mL do fixador a frio 1 (metanol/ácido acético/solução de Ringer na proporção de 4:1:5). Deixar os tubos de amostra durante a noite a 4 °C (mínimo 12 h e máximo 96 h). Centrifugar por 8 min a 180 × g. Descarte o sobrenadante. Vórtice o pellet (a toda velocidade) e, durante o vórtice, adicione lentamente 2 mL do fixador a frio 2 (metanol/ácido acético na proporção de 4:1). Centrifugar por 8 min a 180 × g. Descarte o sobrenadante. Vórtice o pellet (a toda velocidade) e, em seguida, adicione lentamente (dropwise), enquanto vórtice, 2 mL de fixador frio 2 ao pellet. Deixar os tubos de amostra a 4 °C (mínimo 12 h e máximo 96 h). Limpe as lâminas com isopropanol e rotule-as corretamente.NOTA: Use adesivos impressos para rotular, pois a tinta do marcador é facilmente limpa durante o processamento. Centrifugar os tubos de amostra durante 8 min a 180 × g. Transfira o sobrenadante para outro tubo para concentrar as células de acordo com o tamanho do pellet. Vórtice a pelota. Solte 40 μL das células fixas em uma lâmina seca e limpa. Deixe as lâminas secar em temperatura ambiente. Guarde as lâminas em uma caixa ou manche imediatamente para observação. 5. Coloração laranja de acridina (AO) Imergir as lâminas em corante AO por 1 min, seguido de uma lavagem rápida na água destilada e, em seguida, colocar as lâminas em tampão fosfato (pH 6,8) por 1 min. Retire as lâminas da solução tampão e com papel de seda limpo, seque a parte de trás das lâminas e coloque as lâminas em um papel de seda limpo. Solte 20 μL do tampão fosfato em cima da lâmina e cubra-a suavemente com uma lamínula limpa, evitando bolhas de ar. Sele estas lâminas com cimento de silicone.NOTA: Como o AO é sensível à luz e desaparece com o tempo, para um bom contraste e fluorescência, recomenda-se a pontuação das lâminas dentro de 5 dias após a coloração. Guarde sempre as lâminas em câmara fria (4 °C), quando não examinadas. 6. Pontuação de lâminas manchadas Coloque sua lâmina sob um microscópio de fluorescência e examine 1.000 células binucleadas (BNs). Conte manualmente MNs, que são um dos seis biomarcadores de toxicidade. Para isso, peça a dois escores independentes que examinem 500 células/lâmina de BN sob a mesma ampliação.OBS: A seguir estão alguns destaques dos critérios de pontuação, conforme recomendado por Fenech para pontuar as lâminas coradas9Selecione uma célula BN procurando células bem arredondadas com citoplasma intacto, com dois núcleos bem distintos de aproximadamente o mesmo tamanho, forma regular e padrão de coloração. Certifique-se de que o citoplasma da célula BN é distinguível do citoplasma da célula adjacente. Escore um MN, observando que ele é morfologicamente idêntico, mas menor que os núcleos principais; mesmo o maior MN não pode ter mais de 1/3 do diâmetro dos núcleos principais. Pontuar um MN somente se ele não tocar os núcleos principais ou, pelo menos, o limite micronuclear for distinguível do limite dos núcleos principais.