Una técnica optimizada de politransfección inversa basada en células madre embrionarias de ratón para la exploración rápida de las proporciones de ácidos nucleicos

La entrega de ADN y ARN a las células de mamíferos es un pilar fundamental^{de la investigación} biomédica. Un método común para introducir ácidos nucleicos exógenos (NA) en células de mamíferos es a través de la transfección transitoria ^2,3. Esta técnica se basa en la mezcla de NA con reactivos de transfección disponibles en el mercado capaces de administrarlos en las células receptoras. Normalmente, la NA se administra a través de la transfección directa, en la que las células que se adhieren a una superficie bidimensional reciben el complejo de transfección. Si bien la transfección directa para las líneas celulares establecidas más comunes es robusta y los protocolos están bien publicados, los tipos de células más nicho con morfologías no monocapa no transfectan fácilmente, lo que limita la cantidad de NA que se puede administrar y el número de células que la reciben.

Las células madre pluripotentes (PSC) sirven como un modelo atractivo para comprender el desarrollo y como herramienta para la medicina regenerativa, dada su capacidad para dividirse indefinidamente y producir cualquier tipo de célula corporal. En el caso de las PSC de ratón (mPSC), las condiciones de cultivo in vitro de rutina con 2 inhibidores y LIF (2i/LIF) mantienen una morfología de colonia en forma de cúpula, lo que limita directamente el número de células expuestas a una transfección directa ^4,5,6. Para abordar esto, se puede realizar una transfección inversa: las células se agregan a una placa que contiene medios y reactivo de transfección, en lugar de agregar reactivo de transfección a las células adherentes⁷. Si bien esto aumenta el número de células expuestas al reactivo, también requiere que las células pasen y transfecten simultáneamente.

Más allá de las simples transfecciones de NA únicas, los investigadores a menudo tienen como objetivo administrar varias construcciones de NA en una población de células in vitro. Por lo general, esto se logra a través de una co-transfección, donde los NA se mezclan en una proporción determinada (1:1, 9:1, etc.) y luego se combinan con el reactivo de transfección elegido⁸. Esto produce una mezcla de NA y reactivo que conserva la proporción original de NA entre sí: si bien las células en el tratamiento pueden recibir diferentes cantidades de esta mezcla, todas reciben la misma proporción⁹. Si bien esto es ventajoso cuando se conoce la proporción deseada de piezas, determinar esta relación con anticipación puede requerir mucha mano de obra, ya que cada proporción constituye una condición diferente. Una alternativa es realizar una “poli-transfección”, en la que los NA individuales se mezclan con el reactivo de transfección de forma independiente entre sí⁹. Al combinar complejos de transfección que contienen NA individuales (en lugar de combinar NA antes de crear los complejos), los investigadores pueden explorar una amplia gama de estequiometrías de NA en un solo experimento de transfección⁹. Esto es particularmente valioso en los casos en los que se espera que los productos de varios NA interactúen entre sí, como en el caso de los sistemas de transcripción inducibles o los sistemas con retroalimentación incorporada en ^1,10,11. Sin embargo, para hacerlo de manera efectiva, se necesita una alta eficiencia de transfección. De hecho, a medida que aumenta el número de NA transfectadas únicas, la probabilidad de que una célula dada reciba todas las NA deseadas disminuye exponencialmente ^9,12.

El siguiente informe describe un protocolo de transfección inversa para mPSC utilizando un reactivo de transfección basado en lípidos catiónicos, en el que las células se exponen a la mezcla de reactivo y NA durante un máximo de 5 minutos para maximizar la viabilidad y minimizar el tiempo fuera de las condiciones típicas de cultivo. La comparación de este protocolo con la transfección directa estándar de estas células demuestra una mayor eficiencia de transfección y un aumento en el número total de células transfectadas supervivientes. Al combinar esta transfección inversa con una politransfección de tres plásmidos que involucra reporteros fluorescentes simples, se demuestra un potencial ampliado para detectar proporciones de NA con alta eficiencia de transfección.