Оптимизированный метод обратной политрансфекции на основе эмбриональных стволовых клеток мыши для быстрого исследования соотношения нуклеиновых кислот

Доставка ДНК и РНК в клетки млекопитающих служит основой биомедицинских^{исследований1}. Распространенным методом введения экзогенных нуклеиновых кислот (НК) в клетки млекопитающих является транзиторная трансфекция ^2,3. Этот метод основан на смешивании НК с коммерчески доступными реагентами для трансфекции, способными доставить их в клетки-реципиенты. Как правило, НК доставляется путем прямой трансфекции, при которой клетки, прилипшие к двумерной поверхности, получают трансфекционный комплекс. В то время как прямая трансфекция для наиболее распространенных установленных клеточных линий надежна, а протоколы хорошо опубликованы, более нишевые типы клеток с немонослойной морфологией не трансфицируются легко, что ограничивает количество NA, которое может быть доставлено, и количество клеток, которые его получают.

Плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) служат привлекательной моделью для понимания развития и инструментом регенеративной медицины, учитывая их способность делиться неограниченное количество клеток и производить любой тип клеток организма. Для мышиных ПСК (мПСК) рутинные условия культивирования in vitro с 2 ингибиторами и LIF (2i/LIF) поддерживают куполообразную морфологию колонии, непосредственно ограничивая количество клеток, подвергающихся прямой трансфекции ^4,5,6. Для решения этой проблемы можно выполнить обратную трансфекцию: клетки добавляют в чашку, содержащую среду и трансфекционный реагент, вместо того, чтобы добавлять трансфекционный реагент к адгезивным клеткам⁷. Несмотря на то, что это увеличивает количество клеток, подвергающихся воздействию реагента, это также требует одновременного пассажа и трансфекции клеток.

Выходя за рамки простой трансфекции одной НК, исследователи часто стремятся доставить несколько конструкций НК в популяцию клеток in vitro. Обычно это достигается с помощью котрансфекции, при которой НК смешиваются в заданном соотношении (1:1, 9:1 и т.д.), а затем соединяются с выбранным реагентом для трансфекции⁸. В результате получается смесь НК и реагента, которая сохраняет исходное соотношение НК друг к другу – в то время как клетки при лечении могут получать разное количество этой смеси, все они получают одинаковое соотношение⁹. Хотя это выгодно, когда известно желаемое соотношение частей, заблаговременное определение этого соотношения может быть трудоемким, поскольку каждое соотношение представляет собой отдельное условие. Одной из альтернатив является проведение «политрансфекции», при которой отдельные НК смешиваются с трансфекционным реагентом независимо друг^{от друга.} Комбинируя трансфекционные комплексы, содержащие отдельные НК (вместо того, чтобы объединять НК до создания комплексов), исследователи могут исследовать широкий спектр стехиометрий НК в одном эксперименте по трансфекции⁹. Это особенно ценно в тех случаях, когда предполагается, что продукты нескольких СА будут взаимодействовать друг с другом, например, с индуцируемыми транскрипционными системами или системами с обратной связью, встроенными в ^1,10,11. Однако для того, чтобы сделать это эффективно, необходима высокая эффективность трансфекции. Действительно, по мере увеличения числа уникальных трансфицируемых НК вероятность того, что данная клетка получит все желаемые НС, экспоненциально уменьшается ^9,12.

В следующем отчете описывается протокол обратной трансфекции мПСК с использованием реагента для трансфекции на основе катионных липидов, при котором клетки подвергаются воздействию смеси реагента и NA в течение максимум 5 мин для обеспечения максимальной жизнеспособности и минимизации времени вне типичных условий культивирования. Сравнение этого протокола со стандартной прямой трансфекцией этих клеток демонстрирует более высокую эффективность трансфекции и увеличение общего числа выживших трансфицированных клеток. Комбинируя эту обратную трансфекцию с трехплазмидной политрансфекцией с участием простых флуоресцентных репортеров, демонстрируется расширенный потенциал скрининга соотношений NA с высокой эффективностью трансфекции.