Tidlig Unguided Human Brain Organoid Neurovascular nisjemodellering i Permissive Chick Embryo Chorioallantoic Membrane

Menneskelige hjerneorganoider er en fremvoksende teknikk som gjør at vi kan rekapitulere den tidlige utviklingen av den menneskelige hjerne in vitro ^1,2,3. Likevel er en av de største begrensningene i denne modellen mangelen på vaskularisering, som spiller uunnværlige roller, ikke bare i hjernens homeostase, men også i hjernens utvikling⁴. I tillegg til levering av oksygen og næringsstoffer, tyder akkumulerende bevis på at hjernens vaskulære system regulerer nevral differensiering, migrasjon og synaptogenese under utvikling ^5,6. Derfor er det et presserende behov for å etablere pålitelige modeller som kan gi den manglende vaskulære signaleringen og strukturen til hjerneorganoider, og øke kompleksiteten til menneskelig hjerneorganoid generasjon⁷.

Blant de foreslåtte metodene for vaskularisering kan to hovedstrømlinjer vurderes: organoid engrafting i en levende organisme og rent in vitro-teknologier som dyrker endotelceller og nevrale celler 8,9,10,11,12. Intracerebral transplantasjon hos mus er kostbart og tidkrevende, noe som gjør andre teknologier relevante for enklere modeller. Chick chorioallantoic membran (CAM) analysen har blitt brukt mye for å studere angiogenese 13,14,15. I det siste tiåret har flere grupper vellykket enpodet forskjellige typer organoider, inkludert nyre^16,17, hjerte¹⁸ og tumororganoider^19,20, i CAM. Likevel er lite kjent om effekt, toksisitet / avvisning, fysiologisk effekt og metoder for å innpode menneskelige hjerneorganoider i CAM. Et annet interessant og ennå uutforsket aspekt er dannelsen av en kimær blod-hjernebarriere (BBB) mellom CAM og det organoide astrocytiske grensesnittet. Tidligere banebrytende arbeid antydet den antatte muligheten for å generere en BBB i CAM ved å transplantere astrocytter og astrocyttbetinget medium 21,22,23. Imidlertid ser modne astrocytter ut til å være ute av stand til å oppnå dette^24,25. Dermed forblir den astrocytinduserte dannelsen av BBB diskutabel, og transplantasjon av menneskelige hjerneorganoider vil tillate oss å kaste lys over denne kontroversen.

Denne videoartikkelen beskriver en protokoll for en in ovo human hjerneorganoid transplantasjon i CAM som fremmer vekst, forbedring og vaskularisering, noe som resulterer i organoider som omfatter histologisk kompatible BBB-elementer. Her presenterer vi en protokoll som sikrer overlevelse av kyllingembryoet og rapporterer om tillatelsen til CAM for å opprettholde hjerneorganoid vekst.

Hvitleghornkyllingembryoene (Gallus gallus) ble behandlet ved å følge veiledningen for pleie og bruk av forsøksdyr fra Institute of Laboratory Animals Resources, Commission of Life Sciences, National Research Council, USA, og forsøkene ble godkjent av Rådet for omsorg og bruk av forsøksdyr fra Universitetet i Barcelona.

1. Ikke-guidet hjerneorganoidpreparat

1. Oppretthold H9 humane embryonale stamceller (hESCs) i mTESR1 forvarmet ved romtemperatur (RT) under et sammenløp på 70% i 6-brønnsplater belagt med Matrigel oppløst i DMEM (1:40) i en 5% CO₂ -inkubator ved 37 ° C.
   MERK: Matrigel må holdes i is til det brukes som belegg for å forhindre polymerisering.
2. Generer hjerneorganoider etter den ikke-styrte hjerneprotokollen ².
   1. Desosiere H9 hESC ved hjelp av 500 μL av celledissosiasjonsløsningen og inkuber i 3-5 minutter ved 37 °C. Resuspend i mTESR1 som inneholder en ROCK-hemmer Y27632 (endelig konsentrasjon 50 μM) og frø 9000 celler per brønn i en forbehandlet 96-brønnsplate med lav adhesjon.
   2. Når organoidene aggregerer i mTESR1 som inneholder en ROCK-hemmer Y27632 (endelig konsentrasjon 50 μM), overfør dem til induksjonsmedium i 5-6 dager.
   3. Etter ikke-guidet hjerneorganoidprotokoll²⁶, overfør organoidene til nevrale induksjonsmedier ved ~ dager 4-5.
   4. Når de har fått størrelsen og nevroepitelringen, overfør dem til en iskald Matrigel-dråpe. Når Matrigel er polymerisert, overfør organoidene til en 5 cm, petriskål med lav vedheft med 5 ml forvarmet modningsmedium.
   5. Etter 4 dager, legg hjerneorganoider under orbital agitasjon.
3. Samle organoider for høsting i ferske DPBS umiddelbart før podning.

2. Eggvedlikehold, utviklingsaktivering og eggeskallpunktering

1. Oppbevar befruktede egg (ved dag 0) i en inkubator ved 18 °C til bruk.
   MERK: Ved denne temperaturen utvikler de seg ikke, og forblir på samme stadium av modning.
2. Når det er nødvendig for bruk, inkuber dem ved 38 °C og 60 % relativ fuktighet med myk gyngerotasjon i en vinkel på 45 °C.
3. På dag 1, rengjør eggeskalloverflaten med 70% etanol og tørk den med et papirhåndkle for å sterilisere den.
4. Legg en kirurgisk papir selvklebende bandasje, heretter referert til som "bandasje", på toppen av egget, som dekker luftkammeret av egget.
   NOTAT: Dette vil forhindre at støv fra eggeskallet faller inn i CAM der det setter seg fast.
5. Utfør luftkammerets perforeringspunktering, heretter kalt luftkammerhull (ACH), med en steril nål på 21 G x 11/2'', og punkter eggeskallet mykt. Åpne ACH på eggets øvre spiss for å unngå å forstyrre CAM, som på dette punktet ligger skilt fra skallet.
6. For å finne den beste posisjonen for å punktere ACH, bruk en lampe for å bestemme den tynneste eggeskalloverflaten på eggets øvre spiss. Den direkte lysstråleoverføringen indikerer den beste posisjonen for å bore.
7. Dekk ACH med en ny bandasje for å beskytte embryoet fra det ytre miljø og legg egget tilbake i inkubatoren.
8. Fra dette øyeblikket slutter rotasjonen i inkubatoren og opprettholder eggene i vertikal stilling med vinduet på toppen.
   MERK: Dette vil lette utviklingen av embryoet, og CAM blir tilgjengelig på toppen med et luftkammer mellom embryoet og eggeskallet, noe som muliggjør etterfølgende podning.
9. Åpne ACH fra dag 1 til dag 4. Levedyktigheten øker på dag 4 (3 dager før podedagen).

3. Hjerneorganoid poding

1. Utfør poding på dag 7 når CAM er godt utviklet og vaskularisert, og dekker egget over hele embryoet.
2. Fjern bandasjen, og tørk eggeskalloverflaten med 70% etanol for å sterilisere eggeskallet, før du forsiktig utvider ACH til et podevindu.
3. Plasser en ny, større bandasje som dekker forlengelsen utover det endelige podevinduet for å unngå at fragmenter av eggeskall faller inn i CAM-en mens du forstørrer podevinduet.
   MERK: Dette større vinduet er nødvendig for å velge den beste podeposisjonen og for påfølgende poding.
4. Forstørr podevinduet ved å punktere eggeskallet mykt til vinduet når en diameter på ca. 2 cm. Fjern forsiktig kantene på eggeskallvinduet med pinsett til vinduet er forstørret. Fjern de resterende støv- og eggeskallbitene som vil forbli festet til bandasjen ved å forsiktig skrelle av bandasjen.
5. Plasser organoiden med en P200 automatisk pipette. Klipp spissene med steril og skarp saks for å forstørre åpningen i samsvar med organoidens størrelse og forhindre skade på organoiden, eller bruk bredsporede sterile spisser. Samle organoid i et maksimalt volum på 50 μL PBS og overfør det direkte til CAM, på en side motsatt plasseringen av embryoet.
6. Sørg for at posisjonen til transplantatet er fjernt fra eggeplommen for å unngå brudd under høsting, og plasser det helst i nærheten av et blodkar.
7. Plasser en dråpe på 7 μL Matrigel som omgir organoiden etter å ha plassert organoid på CAM.
   MERK: Dette vil forhindre at organoiden beveger seg rundt membranen.
8. Lukk vinduet med et lite stykke parafilm som passer til den nøyaktige størrelsen på vinduet og fest det til skallet med en selvklebende bandasje.
   MERK: Det er viktig å dekke vinduet helt med parafilmen for å unngå at embryoet tørker ut mens du tillater gassutveksling. Avgrens utvidelsen av vindusdekningen riktig, unngå å overskride vinduet, da det kan hindre nødvendig gassutveksling for riktig embryoutvikling²⁷.

4. Transplantert organoid høsting

1. Slakt de podede organoidene og den omkringliggende CAM på dag 12 av kyllingutviklingen, tilsvarende 38 Hamburger og Hamilton utviklingsstadium (HH38) ²⁸, 5 dager etter poding. På dette stadiet er CAM fullt differensiert med moden vaskulatur mens fjærbakteriene dekker vingene så vel som embryoets øvre øyelokk.
2. Når du fjerner limbandasjen, forstørres vinduet ytterligere for å lette prøvehøstingen ved hjelp av saks og fin pinsett.
3. Visualiser organoid ved hjelp av en binokulær disseksjonsmikroskopi om nødvendig, etterfulgt av et 2 minutters prefikseringstrinn med 4% paraformaldehyd (PFA) for å hjelpe organoid og alternativ høsting.
4. Samle en 1,5 cm² seksjon av CAM som inneholder organoid.
5. Eksempel på fiksering
   1. Vask prøvene med 1x PBS og fest dem med 4 % PFA (i PBS, pH 7,2) i 30 minutter ved 4 °C. Vask deretter prøvene i 3 x 5 min i PBS.
   2. Oppbevar prøvene ved 4 °C i PBS med natriumazid eller beskytt dem direkte i 30 % sukrose-PBS over natten ved 4 °C.
   3. Ved kryoproteksjon legges prøvene inn i optimal skjæretemperaturforbindelse (OCT) og oppbevares ved -20 °C til snitt. Klipp 20 μm tykke vevskiver ved hjelp av en kryostat og samle dem på xylaniserte lysbilder. Oppbevar lysbildene ved -20 °C til de brukes til flekker.

5. Immunfluorescens

1. Fjern OCT. fra seksjonene med en PBS-oppløsning med 0,1% Triton X-100 (PBS-T) i 10 minutter ved romtemperatur (RT).
2. Behandle seksjonene med en blokkeringsløsning (BS) med en 2% BSA, 3% eselserum PBS-T 0,01% løsning i 1 time ved RT.
3. Fortynn det valgte primære antistoffet (se materialfortegnelsen) i BS og inkuber prøvene over natten ved 4 °C.
4. Neste dag, vask prøvene 3 x 10 min i 1x PBS ved RT.
5. Fortynn det sekundære antistoffet i BS og inkuber i 2 timer ved RT (se materialfortegnelsen).
6. Inkuber prøvene i 10 minutter med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) for å markere cellekjernene ved RT, fortynnet i PBS-T ved en 1:1000 fortynning.
7. Monter lysbildene med monteringsmedium og deksel med glassdeksler.
8. Ta alle bilder ved hjelp av et bredfeltfluorescensmikroskop på 2,5, 10, 20 og 40x.
9. Oppbevar skivene på 4 °C.

6. Farging av hematoksylin og eosin (H&E)

MERK: For å bevise at podingen fungerte, utfør H&E-farging.

1. Fjern OCT med PBS-T 0,1% i 10 min ved RT.
2. Utfør seriell dehydrering i en hette som følger: 10 min i destillert vann (DW), 45 s i hematoksylin, 1 min i DW, 20 s i PBS, 2 x 30 s i 70% EtOH, 2 x 30 s i 80% EtOH, 2 x 30 s i 96% EtOH, 30 s i eosin, 2 x 15 s i 96% EtOH, 2 x 15 s i 100% EtOH, 1 min i xylol-100% ETOH, 1 min i xylol, 1 min i xylol (frisk).
3. Monter glassdekslene med et xylenbasert monteringsmedium.

Velge embryomodningsplan for transplantasjonen
Forsøket begynner ved D0 når befruktede egg ruges ved 38 °C og 60 % relativ fuktighet. Den chorioallantoiske membranen (CAM) er en svært vaskularisert ekstraembryonal membran som utvikler seg etter egginkubasjon. Den dannes ved fusjon av allantois og chorion. Ved D1, etter 24 timers inkubasjon, punkteres luftkammeret for å forhindre at CAM festes til den indre skallmembranen. Punktering av luftkammeret ved D1 forbedrer kvaliteten på luftkammeret sammenlignet med punktering på senere stadier (D4). Alternativ behandling fortsetter å vokse frem til D12 når den omslutter hele egginnholdet og fester seg godt til den indre skallmembranen (figur 1). Hullet laget på D7 er forstørret for å lette prøvehøstingen. D7 er den optimale tiden for poding når CAM når modenhet og dekker eggeplommesekken og embryooverflaten. På dette stadiet forstørres luftkammerhullet, og organoidene overføres til CAM ved hjelp av en automatisk pipette.

Hjerneorganoid poding
Gjennom den iboende modningen av hjerneorganoider in vitro endres deres cellulære sammensetning fra nevrale forfedre til modne nevroner og glialceller. Nevrovaskulatur og nevrogenese er blandede og gjensidig avhengige utviklingsprosesser hos virveldyr, og signaleringen som fører til denne crosstalken er svært avhengig av modningsstadiet til den nevrale motparten²⁹. Nevrale progenitorer er den viktigste kilden til proangiogene faktorer i den utviklende hjernen ^29,30. Tvert imot støtter nevroner og astrocytter neoangiogenese i modne stadier og voksen alder gjennom sekresjon av vaskulær endotelial vekstfaktor^31,32. Disse endringene i hjernens cytoarkitektur, som også gjenspeiles i hjerneorganoider, kan føre til differensielle endringer i integrasjon og respons på CAM-engrafting, avhengig av modningsstadiet av hjerneorganoider. Derfor podet vi hjerneorganoider på differensieringsdag 13 in vitro (DIV), når nevroepitelceller og radiale glia utvider seg; ved DIV 37, ved begynnelsen av nevrogenese; ved DIV 60, når nevrogenese er robust og nevroner av forskjellige identiteter er terminalt differensiert; og ved DIV 120, når en mengde modne nevroner befolker organoidet, er det også utbredt å generere et velutviklet nevronnettverk og astrogenese.

I alle tilfeller ble prøvene samlet inn etter 5 dager med in ovo (DIO) inkubasjon. For å unngå skjevheter på grunn av batcheffekt i hjerneorganoider, ble alle sammenligninger mellom podede og ikke-podede organoider utført i samme batch på en parvis måte. Organoider ble avledet fra minst to uavhengige eksperimenter per tidspunkt og totalt seks uavhengige differensieringer. Poting av flere modningsstadier ble utført parallelt i hvert podeforsøk. Ved transplantasjon fortsatte organoidene modningsprosessen ved siden av alternative behandlingskar uten holdepunkter for infiltrasjon av blodkar i organoiden (figur 2).

Organoid overlevelse ved poding varierer fra 80% hos de yngste og faller til ~ 66% i modne organoider etter 5 dager etter poding, noe som tyder på at permissivitet og organoid poding plastisitet kan endres over tid (tabell 1). Den organoide levedyktigheten ble bestemt av tilstedeværelsen av pyknotiske kjerner i H&E-farginger. Antallet pyknotiske kjerner var likt mellom transplanterte og ikke-transplanterte kontrollorganoider (figur 3), noe som tyder på at alternativ behandling er permissivt for å opprettholde levende organoid ved transplantasjon. Videre ble det ikke påvist histologisk eller hemogen frigjøring ved CAM, og embryoene forblir i live, noe som tyder på at verken podningsprosedyren eller organoiden forstyrrer CAMs integritet eller påvirker embryoutviklingen betydelig.

Cellesammensetning i podede hjerneorganoider
Ikke-styrte hjerneorganoider har en markert inter- og intraorganoid cellulær variabilitet. Imidlertid er de overveiende nevrale, og genererer bølger av forfedre, nevroner og astrocytter i et sekvensielt tempo ^2,26. Deretter evaluerte vi om poding endrer nevrale sammensetningen i hjerneorganoider. Yngre organoider (13 DIV + 5 DIO: 18 dager) viser ingen forskjeller fra deres kontroll ikke-podede organoider i nærvær av nevroner (TUBB3 ⁺). Ved senere modningsstadier (60 DIV +5 DIO: 65 dager og 120 DIV + 5 DIO: 125 dager) reduseres andelen nevroner (TUBB3⁺) dramatisk sammenlignet med andelen ikke-podede organoider (figur 4). I ikke-podede organoider modnet for 60 DIV, er nevroner spredt rundt organoider.

Spesielt antall og lokalisering av gliafibrillære sure proteinpositive (GFAP⁺) astrocytter viste en økning sammenlignet med de som ble observert i de ikke-transplanterte kontrollene. Dessuten fikk disse GFAP⁺ -astrocyttene en uventet lokalisering på den ytre siden av organoiden. I 18 DIV, frie organoider (ikke-podet), kan få astrocytter ses og ingen strukturell fordeling kunne påvises; Tvert imot virker de homogent spredt utover organoiden (figur 3).

Figur 1: Tidslinje for oppsett av alternativ behandling for organoidtransplantasjon. (A) Påføring av kirurgisk papirlimbandasje på toppen av egget. (B) Lag et hull i skallet med en nål over limbandasjen. (C) Åpne eggeskallets vindu, sett fra toppen, klar for transplantasjon av en (D) menneskelig hjerneorganoid (dag 60). Skala bar = 100 μm. (E) Visualisering av engrafted organoid ved CAM etter 5 dager med i ovo inkubasjon. (F) Kjennetegn på hjernens organoidutvikling fra dag 0 til dag 120. Pilen indikerer plasseringen av organoiden. Forkortelse: CAM = chorioallantoic membran. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2 Farging av hematoksylin og eosin av podede organoider i chorioallantoic membran. (A) 13 DIV + 5 DIO organoid; (B) 37 DIV + 5 DIO organoid; (C) 60 DIV + 5 DIO organoid; og (D) 120 DIV + 5 DIO organoid; Røde firkanter markerer organoiden. Skala bar = 500 μm. Forkortelser: DIV = dag in vitro; DIO = dag i ovo. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3 Immunocytokjemi av organoider i ulike utviklingsstadier. GFAP ble brukt til farging og DAPI for kjernene. Skala bar = 100 μm. (A,B) Bilder av samme 13 DIV + 5 DIO podet organoid hvor astrocytter ses rundt kanten av organoiden. (C) Bilde av 18 DIV fri organoid hvor astrocytter er knapt synlige. Forskjellen mellom frie og podede organoider er svært merkbar. (D,E) Bilder av 37 DIV + 5 DIO podet organoid hvor få astrocytter kan sees. (F) Bilde av 42 DIV fri organoid. Gule piler indikerer plasseringen av astrocyttene. Forkortelser: DIV = dag in vitro; DIO = dag i ovo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; GFAP = glialfibrillært surt protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Immuncytokjemi av 120 DIV-organoider. TUBB3 ble brukt til farging av nevronene og DAPI for kjernene. Skala bar = 100 μm; bildene ble tatt ved 20x. (A) En 120 DIV +5 DIO podet organoid hvor få nevroner kan sees. (B) En 125 DIV, fri organoid med mange nevroner. Stjernen indikerer plasseringen av organoiden mens den stiplede linjen representerer grensen mellom organoid og CAM (bestemt ved histologisk analyse). Forkortelser: DIV = dag in vitro; DIO = dag i ovo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; CAM = chorioallantoisk membran. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Embryooverlevelse etter organoid transplantasjon (alternativ behandling). Forkortelser: DIV = dag in vitro; DIO = dag i ovo; CAM = chorioallantoisk membran.

I denne studien beskriver vi en detaljert protokoll med mange viktige trinn som gir gunstig vekst og utvikling av menneskelige hjerneorganoider ved poding uten å forstyrre overlevelsen av kyllingembryoene. Vi anbefalte bruk av sterile nåler for å punktere eggets luftkammer etter 24 timers inkubasjon (dag 1). I tillegg prøvde vi også å gjøre punkteringen på dag 4 (etter å ha sjekket gjennom eggeskallet med lys for å teste utviklingen av vaskulaturen for å være sikker på at vi bare jobbet med friske embryoer). Dette resulterte imidlertid i en nedgang i embryoets levedyktighet på grunn av nærheten til CAM-karene til eggeskallet. Det skal bemerkes at bruk av for mye kraft kan føre til å bryte eggeskallet med den påfølgende skaden på CAM-vaskulaturen. Bruken av en lyskilde for å oppdage tynne områder av eggeskallet var nyttig for å lage stumpe hull samtidig som det forhindret overpenetrasjon og passerte gjennom egget, noe som førte til invasjon av CAM.

Selv om eggrotasjon virker obligatorisk for riktig utvikling av kyllingembryoer under inkubasjon, er det nødvendig å unngå det etter punktering av luftkammeret. Fjerning av albumin var ikke berettiget for denne modellen, og det var heller ikke tilsetning av PBS for å unngå dehydrering av egget. Videre bør bruk av 70% etanoloppløsning gjøres klokt, med ekstra forsiktighet for å tørke gjenværende etanoloppløsning på skallet for å bevare embryonal levedyktighet. Et annet kritisk punkt er størrelsen på eggeskallhullet som brukes til engraftmentet, noe som krever å balansere det minste mulige hullet som gjør det mulig for podemanipulasjonskomforten. Valget av embryonale stadium for poding (E7) ble drevet av modningsstadiet av CAM og dens relative størrelse, favoriserer integrasjonen av transplantasjonen. Men i tilfelle de transplanterte organoidene krever lengre tid i ovomodning , kan transplantasjonen utføres på dag E5.5/6. Hjernens organoidvariabilitet kontrolleres for å sikre eksperimentell levedyktighet. Organoider av samme alder utviser lignende størrelser, og det er viktig å merke seg at, uavhengig av organoidernes alder, ble de alle inkubert i 5 dager etter transplantasjon. Videre, for konsistens, ble kontrollorganoidene omhyggelig valgt for å matche den nøyaktige størrelsen på deres innpodede kolleger. Et annet teknisk aspekt, relevant for å støtte overlevelsen av både de podede organoider og embryoet, er å lukke podehullet med et firkantet stykke parafilm for å opprettholde et kontrollert ovo-miljø .

I motsetning til våre opprinnelige hypoteser, overlevde unge organoider bedre etter podeprosessen og alternativ integrasjon enn de eldre. Vi antydet at yngre organoider er mer plastiske på grunn av deres berikede tilstedeværelse i tidlige forfedre³³, mens modne nevroner krever et permissivt nevronmiljø for vedlikehold. Videre ble det påvist cytoarkitektoniske forandringer i de tidlige (D18) hjerneorganoidtransplantatene i fordelingen av astrocytter. Spesielt oppdaget vi at astrocytter differensierte på dette tidlige stadiet bare når de ble podet og de distribuerte seg for å generere en pseudokapsel under organoidoverflaten. Denne strukturen kan være et minne om organoidens potensial for å generere et nevrovaskulært grensesnitt som kan etterligne BBB. Alternativt kan den økte reaktiviteten til astrocytter, plassert i en barrierelignende struktur, være en indikasjon på en immunogen respons av organoid til utskilt signalering fra CAM. Imidlertid er det behov for ytterligere arbeid for å demonstrere denne hypotesen. Oppsummert beskriver dette papiret trinnene for å engraft organoider av flere utviklingsstadier i kyllingens CAM, som er en mer ettergivende situasjon for organoider for tidlig utvikling, og den cellulære effekten av disse podingen i nevroner og GFAP.