Hier presenteren we een protocol om menselijke hersenorganoïden in meerdere rijpingsstadia te enten in het chorioallantoïsche membraan (CAM) van het kuiken. Hersenorganoïden werden gekweekt volgens ongeleide gestandaardiseerde protocollen.
Het enten van organoïden in gevasculariseerde weefsels in modeldieren, zoals het immunodeficiënte chorioallantoïsche membraan (CAM) van muizen of kuikenembryo’s, is efficiënt gebleken voor neovascularisatiemodellering. De CAM is een rijk gevasculariseerd extraembryonaal membraan, dat een beperkte immunoreactiviteit vertoont, en wordt zo een uitstekend hostingmodel voor celtransplantaties van menselijke oorsprong.
Dit artikel beschrijft de strategie om menselijke hersenorganoïden die in meerdere rijpingsstadia zijn gedifferentieerd, in de CAM te enten. De cellulaire samenstelling van hersenorganoïden verandert met de tijd en weerspiegelt de mijlpalen van de ontwikkeling van het menselijk brein. We entten hersenorganoïden in relevante rijpingsstadia: neuro-epitheliale expansie (18 DIV), vroege neurogenese (60 DIV) en vroege gliogenese (180 DIV) in de CAM van embryonale dag (E)7 kippenembryo’s. Geënte hersenorganoïden werden 5 dagen later geoogst en hun histologische kenmerken werden geanalyseerd.
Er werden geen histologische tekenen van neovascularisatie in de getransplanteerde organoïden of abnormale bloedvaten naast de transplantaties gedetecteerd. Bovendien werden opmerkelijke veranderingen waargenomen in de cellulaire samenstelling van de geënte organoïden, namelijk een toename van het aantal gliale fibrillaire zure eiwit-positief-reactieve astrocyten. De cytoarchitecturale veranderingen waren echter afhankelijk van het rijpingsstadium van de organoïde. Al met al suggereren deze resultaten dat hersenorganoïden kunnen groeien in de CAM, en ze vertonen verschillen in de cytoarchitectuur, afhankelijk van hun rijpingsstadium bij het enten.
Menselijke hersenorganoïden zijn een opkomende techniek die ons in staat stelt om de vroege ontwikkeling van het menselijk brein in vitro te recapituleren 1,2,3. Desalniettemin is een van de belangrijkste beperkingen van dit model het gebrek aan vascularisatie, dat niet alleen een onmisbare rol speelt bij de homeostase van de hersenen, maar ook bij de ontwikkeling van dehersenen4. Naast de afgifte van zuurstof en voedingsstoffen, suggereert het toenemende bewijs dat het vasculaire systeem van de hersenen neurale differentiatie, migratie en synaptogenese reguleert tijdens de ontwikkeling 5,6. Daarom is er dringend behoefte aan betrouwbare modellen die de ontbrekende vasculaire signalering en structuur aan hersenorganoïden kunnen leveren, waardoor de complexiteit van menselijke hersenorganoïdegeneratie7 wordt vergroot.
Van de voorgestelde methoden voor vascularisatie kunnen twee belangrijke stroomlijnen worden overwogen: organoïde-enting in een levend organisme en puur in-vitrotechnologieën die endotheelcellen en neurale cellen samen kweken 8,9,10,11,12. Intracerebrale transplantatie bij muizen is kostbaar en tijdrovend, waardoor andere technologieën relevant zijn voor eenvoudigere modellen. De kuikenchorioallantoïsche membraan (CAM)-test is uitgebreid gebruikt om angiogenese 13,14,15 te bestuderen. In het afgelopen decennium hebben verschillende groepen met succes verschillende soorten organoïden, waaronder nier16,17, cardiale18 en tumororganoïden19,20, in CAM’s geënt. Toch is er weinig bekend over de werkzaamheid, toxiciteit/afstoting, fysiologisch effect en methoden om menselijke hersenorganoïden in de CAM te enten. Een ander interessant en nog onontgonnen aspect is de vorming van een chimere bloed-hersenbarrière (BBB) tussen de CAM en de organoïde astrocytaire interface. Eerder baanbrekend werk suggereerde de vermeende haalbaarheid van het genereren van een BBB in de CAM door astrocyten en astrocyt-geconditioneerd medium 21,22,23 te transplanteren. Volwassen astrocyten lijken echter niet in staat te zijn om deze 24,25 te bereiken. De door astrocyten geïnduceerde vorming van de BBB blijft dus discutabel, en het transplanteren van menselijke hersenorganoïden zou ons in staat stellen licht te werpen op deze controverse.
Dit video-artikel beschrijft een protocol voor een in ovo menselijke hersenorganoïdetransplantatie in CAM die groei, verbetering en vascularisatie bevordert, wat resulteert in organoïden die histologisch compatibele BBB-elementen bevatten. Hier presenteren we een protocol dat de overleving van het kippenembryo garandeert en rapporteren we over de toelaatbaarheid van de CAM om de groei van hersenorganoïden te ondersteunen.
In deze studie beschrijven we een gedetailleerd protocol met tal van belangrijke stappen die zorgen voor een gunstige groei en ontwikkeling van menselijke hersenorganoïden bij transplantatie zonder de overleving van de kippenembryo’s te verstoren. We adviseerden het gebruik van steriele naalden om de luchtkamer van het ei te doorboren na 24 uur incubatie (dag 1). Daarnaast probeerden we ook de punctie op dag 4 te maken (na het controleren van de eierschaal met licht om de ontwikkeling van het vaatstelsel te testen om er…
The authors have nothing to disclose.
We danken Dr. Alcántara en Dr. Ortega van UB en de rest van de leden in het laboratorium van Dr. Acosta voor de inzichtelijke discussies. S.A. is Serra-Hunter collega-assistent-professor van de Generalitat de Catalunya aan de Universitat de Barcelona.
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |