Denne protokollen inneholder et sett med nøytrofile funksjonsanalyser som skal brukes som en screeningsmetode for å dekke funksjoner fra forskjellige signalveier. Protokollen inkluderer en innledende og enkel evaluering av cellelevedyktighet, renhet, reaktiv oksygenartsproduksjon, sanntidsmigrasjon, fagocytose og et foreløpig forslag om nøytrofile ekstracellulære feller.
Neutrofiler er kjent som en av de første forsvarslinjene i den medfødte immunresponsen og kan utføre mange spesielle cellulære funksjoner, som kjemotaksis, omvendt migrasjon, fagocytose, degranulering av cytotoksiske enzymer og metabolitter og frigjøring av DNA som nøytrofile ekstracellulære feller (NET). Neutrofiler har ikke bare tett regulert signalering selv, men deltar også i reguleringen av andre komponenter i immunsystemet. Siden ferske nøytrofiler er terminalt differensierte, kortvarige og svært variable blant individer, er det viktig å få mest mulig ut av de innsamlede prøvene. Forskere må ofte utføre screeninganalyser for å vurdere en oversikt over de mange nøytrofile funksjonene som kan påvirkes av spesifikke forhold som vurderes. Et sett med tester etter en enkelt isolasjonsprosess av nøytrofiler med normal tetthet ble utviklet for å imøtekomme dette behovet, og søkte en balanse mellom hastighet, omfattende, kostnad og nøyaktighet. Resultatene kan brukes til å resonnere og veilede grundige oppfølgingsstudier. Denne prosedyren kan utføres på en gjennomsnittlig tid på 4 timer og inkluderer evaluering av cellelevedyktighet, produksjon av reaktive oksygenarter (ROS), sanntidsmigrasjon og fagocytose av gjær på glassglass, og etterlater nok celler til mer detaljerte tilnærminger som omics-studier. Videre inkluderer prosedyren en måte å enkelt observere et foreløpig forslag til NET etter rask panoptisk farging observert ved lysmikroskopi, med mangel på spesifikke markører, om enn nok til å indikere om ytterligere innsats på den måten ville være verdt. Mangfoldet av testede funksjoner kombinerer vanlige punkter blant testene, noe som reduserer analysetiden og utgiftene. Prosedyren ble kalt NeutroFun Screen, og selv om den har begrensninger, balanserer den de nevnte faktorene. Videre er målet med dette arbeidet ikke et bestemt testsett, men snarere en retningslinje som enkelt kan justeres til hvert laboratoriums ressurser og krav.
Neutrofiler er de mest tallrike medfødte immuncellene i humant blod og er kjent for å spille en viktig rolle i infeksjon og betennelse, og er de første respondentene som kommer til stedetfor vevskader. I de senere år har det vært en økende anerkjennelse av den avgjørende rollen som nøytrofiler spiller i en rekke sykdommer og i å støtte homeostase2. Neutrofiler har ikke bare tett regulert signalering selv, men deltar også i reguleringen av andre komponenter i immunsystemet 3,4,5. Derfor er undersøkelse av nøytrofiler og deres mange uvanlige cellulære funksjoner, som kjemotaksis, omvendt migrasjon6, fagocytose7, respiratorisk utbrudd8 og frigjøring av nøytrofile ekstracellulære feller (NET)7, avgjørende i mange forskningssammenhenger der det er nødvendig å vurdere potensielle nøytrofile funksjonelle, morfologiske, eller molekylære endringer utløst av spesifikke forhold som analyseres.
Ferskt isolerte nøytrofiler er terminalt differensierte, kortvarige, svært dynamiske og lett aktiverte9. Imidlertid er en effektiv lagringsmetode som ikke påvirker nøytrofilresponsene ennå ikke oppnådd, noe som gjør det utfordrende å utføre flere analyser som må være uavbrutt. Videre kan tidligere beskrevne funksjonelle analyser10,11, basert på analyser som krever cytometri og/eller fluorescerende farging, ikke være et levedyktig valg når en bred og innledende evaluering av nøytrofilen er nødvendig.
For å løse disse problemene beskriver denne protokollen et sett med tester som kan utføres etter en enkelt isolasjonsprosess, inkludert evaluering av cellelevedyktighet, produksjon av reaktive oksygenarter (ROS), sanntidsmigrasjon og fagocytose av Saccharomyces cerevisiae, hvis resultater kan brukes til å resonnere grundige oppfølgingsstudier. Denne prosedyren, kalt NeutroFun Screen, ble designet for å omfatte de ledende effektoraktivitetene, unntatt degranulering, og kan fullføres på en gjennomsnittlig tid på 4 timer, inkludert 1 time aktivering. I tillegg kan de gjenværende cellene brukes til mer detaljerte tilnærminger som omics-studier. Fordelen med denne metoden ligger i balansen mellom hastighet, omfattende, kostnad og nøyaktighet.
Videre er det en måte å enkelt observere et foreløpig forslag til NET, uten spesifikke markører, men nok til å indikere om ytterligere innsats i den retningen ville være verdt. Mangfoldet av testede funksjoner tar sikte på å kombinere felles poeng blant tester, redusere analysetiden og utgiftene. Hovedmålet med denne metoden er å gi en balansert, funksjonell analyse med hensyn til hastighet, omfattende, kostnad og nøyaktighet som gir en oversikt over nøytrofilens respons, noe som gjør det til et nyttig første skritt i å undersøke effekten av nye stimuli på nøytrofiler med normal tetthet.
Nøytrofiler er svært dynamiske og responsive celler som er kortvarige og ennå ikke kan kryopreserveres19, noe som gjør undersøkelser av deres biologi utfordrende. Derfor er det viktig å følge nøye skritt for å oppnå levedyktige, berikede og hvilende nøytrofiler11,20. Denne studien benyttet en tetthetsbasert isolasjonsteknikk som legger vekt på mild og minimal manipulasjon, samt bruk av lave temperaturer frem til aktiveringstrin…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner følgende finansieringsorganer: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP og FINATEC.
CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
DNAse I | Sigma – Aldrich | DN 25 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma – Aldrich | E5134 | |
Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
Glass slide | Exacta | 7102 | |
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma – Aldrich | 55037C | |
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma – Aldrich | H4641 | |
Heparin | Blau | 7896014655229 | |
Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma – Aldrich | F3506 | |
Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma – Aldrich | P8139 | |
Phosphate buffered saline tablet | Sigma – Aldrich | P4417 | |
ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
Safranin | Sigma – Aldrich | 50240 | |
Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
Sonicator | Qsonica | Q125 | |
Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |