Um conjunto de técnicas de triagem para uma rápida visão geral da função dos neutrófilos
Summary
Este protocolo apresenta um conjunto de ensaios funcionais de neutrófilos para ser usado como um método de triagem para cobrir funções de diferentes vias de sinalização. O protocolo inclui uma avaliação inicial e simples da viabilidade celular, pureza, produção de espécies reativas de oxigênio, migração em tempo real, fagocitose e uma sugestão preliminar de armadilhas extracelulares para neutrófilos.
Abstract
Os neutrófilos são conhecidos como uma das primeiras linhas de defesa da resposta imune inata e podem desempenhar muitas funções celulares particulares, como quimiotaxia, migração reversa, fagocitose, degranulação de enzimas e metabólitos citotóxicos e liberação de DNA como armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs). Os neutrófilos não só têm sinalização fortemente regulada, mas também participam da regulação de outros componentes do sistema imunológico. Como os neutrófilos frescos são terminalmente diferenciados, de curta duração e altamente variáveis entre os indivíduos, é importante aproveitar ao máximo as amostras coletadas. Os pesquisadores muitas vezes precisam realizar ensaios de triagem para avaliar uma visão geral das muitas funções dos neutrófilos que podem ser afetadas por condições específicas sob avaliação. Um conjunto de testes seguindo um único processo de isolamento de neutrófilos de densidade normal foi desenvolvido para atender a essa necessidade, buscando um equilíbrio entre rapidez, abrangência, custo e acurácia. Os resultados podem ser usados para fundamentar e orientar estudos de seguimento aprofundados. Este procedimento pode ser realizado em um tempo médio de 4 h e inclui a avaliação da viabilidade celular, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), migração em tempo real e fagocitose de leveduras em lâminas de vidro, deixando células suficientes para abordagens mais detalhadas, como estudos ômicos. Além disso, o procedimento inclui uma maneira de observar facilmente uma sugestão preliminar de TNEs após coloração panóptica rápida observada por microscopia de luz, com falta de marcadores específicos, embora suficientes para indicar se esforços adicionais nesse sentido valeriam a pena. A diversidade de funções testadas combina pontos comuns entre os testes, reduzindo o tempo e os gastos da análise. O procedimento foi denominado NeutroFun Screen e, apesar de apresentar limitações, equilibra os fatores supracitados. Além disso, o objetivo deste trabalho não é um conjunto de testes definido, mas sim uma diretriz que possa ser facilmente ajustada aos recursos e demandas de cada laboratório.
Introduction
Os neutrófilos são as células imunes inatas mais abundantes no sangue humano e são conhecidos por desempenhar um papel importante na infecção e inflamação, sendo os primeiros respondedores a chegar ao local do dano tecidual1. Nos últimos anos, tem havido um crescente reconhecimento do papel crucial que os neutrófilos desempenham em uma variedade de doenças e no suporte da homeostase2. Os neutrófilos não só têm sinalização fortemente regulada, mas também participam da regulação de outros componentes do sistema imune 3,4,5. Portanto, investigar os neutrófilos e suas diversas funções celulares incomuns, como quimiotaxia, migraçãoreversa6, fagocitose7, burst respiratório8 e liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs)7, é imperativo em inúmeros contextos de pesquisa onde é necessário avaliar as potenciais alterações funcionais, morfológicas ou moleculares dos neutrófilos desencadeadas por condições específicas em análise.
Os neutrófilos recém-isolados são terminalmente diferenciados, de curta duração, altamente dinâmicos e facilmente ativados9. No entanto, um método de armazenamento eficiente que não afete as respostas dos neutrófilos ainda não foi alcançado, tornando desafiadora a realização de múltiplos ensaios que devem ser ininterruptos. Além disso, análises funcionais previamentedescritas10,11, baseadas em ensaios que requerem citometria e/ou coloração fluorescente, podem não ser uma escolha viável quando uma avaliação ampla e inicial dos neutrófilos é necessária.
Para resolver essas questões, este protocolo descreve um conjunto de testes que podem ser realizados após um único processo de isolamento, incluindo a avaliação da viabilidade celular, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), migração em tempo real e fagocitose de Saccharomyces cerevisiae, cujos resultados podem ser usados para fundamentar estudos de seguimento aprofundados. Este procedimento, denominado NeutroFun Screen, foi projetado para abranger as principais atividades efetoras, exceto a degranulação, e pode ser concluído em um tempo médio de 4 h, incluindo 1 h de ativação. Além disso, as células remanescentes podem ser usadas para abordagens mais detalhadas, como estudos ômicos. A vantagem desse método está no equilíbrio entre rapidez, abrangência, custo e precisão.
Além disso, há uma maneira de observar facilmente uma sugestão preliminar de NETs, sem marcadores específicos, mas o suficiente para indicar se mais esforços nessa direção valeriam a pena. A diversidade de funções testadas visa combinar pontos comuns entre os testes, reduzindo o tempo de análise e os gastos. O principal objetivo deste método é fornecer uma análise funcional equilibrada em relação à velocidade, abrangência, custo e acurácia que permita uma visão geral da resposta dos neutrófilos, tornando-se um passo inicial útil na investigação dos efeitos de novos estímulos sobre os neutrófilos de densidade normal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os neutrófilos são células altamente dinâmicas e responsivas, de curta duração e ainda não podem ser criopreservados19, o que torna as investigações sobre sua biologia desafiadoras. Portanto, é essencial seguir passos cuidadosos para obter neutrófilos viáveis, enriquecidos e em repouso11,20. Este estudo empregou uma técnica de isolamento baseada em densidade que enfatiza a manipulação suave e mínima, bem como o uso de baixa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
As agências de fomento FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP e FINATEC são reconhecidas pelos autores.
Materials
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma – Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma – Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma – Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma – Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma – Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma – Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma – Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma – Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
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