Een reeks screeningstechnieken voor een snel overzicht van de neutrofielenfunctie
Summary
Dit protocol bevat een reeks neutrofiele functionele assays die kunnen worden gebruikt als screeningsmethode om functies van verschillende signaalroutes te dekken. Het protocol omvat een eerste en eenvoudige evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen, zuiverheid, productie van reactieve zuurstofsoorten, real-time migratie, fagocytose en een voorlopige suggestie van extracellulaire neutrofiele vallen.
Abstract
Neutrofielen staan bekend als een van de eerste verdedigingslinies in de aangeboren immuunrespons en kunnen veel specifieke cellulaire functies uitvoeren, zoals chemotaxis, omgekeerde migratie, fagocytose, degranulatie van cytotoxische enzymen en metabolieten en afgifte van DNA als neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s). Neutrofielen hebben niet alleen zelf een strak gereguleerde signalering, maar nemen ook deel aan de regulatie van andere componenten van het immuunsysteem. Aangezien verse neutrofielen terminaal gedifferentieerd zijn, van korte duur zijn en zeer variabel zijn tussen individuen, is het belangrijk om het meeste uit de verzamelde monsters te halen. Onderzoekers moeten vaak screeningstests uitvoeren om een overzicht te krijgen van de vele neutrofiele functies die kunnen worden beïnvloed door specifieke omstandigheden die worden geëvalueerd. Om aan deze behoefte te voldoen, werd een reeks tests ontwikkeld na een enkel isolatieproces van neutrofielen met normale dichtheid, waarbij werd gezocht naar een evenwicht tussen snelheid, volledigheid, kosten en nauwkeurigheid. De resultaten kunnen worden gebruikt om diepgaande vervolgstudies te beredeneren en te begeleiden. Deze procedure kan worden uitgevoerd in een gemiddelde tijd van 4 uur en omvat de evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen, de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), real-time migratie en fagocytose van gist op glasplaatjes, waardoor er voldoende cellen overblijven voor meer gedetailleerde benaderingen zoals omics-studies. Bovendien omvat de procedure een manier om gemakkelijk een voorlopige suggestie van NET waar te nemen na snelle panoptische kleuring waargenomen door lichtmicroscopie, met een gebrek aan specifieke markers, zij het voldoende om aan te geven of verdere inspanningen op die manier de moeite waard zouden zijn. De diversiteit aan geteste functies combineert gemeenschappelijke punten tussen tests, waardoor de analysetijd en -kosten worden verminderd. De procedure kreeg de naam NeutroFun Screen, en hoewel het beperkingen heeft, brengt het de bovengenoemde factoren in evenwicht. Bovendien is het doel van dit werk niet een definitieve testset, maar eerder een richtlijn die gemakkelijk kan worden aangepast aan de middelen en eisen van elk lab.
Introduction
Neutrofielen zijn de meest voorkomende aangeboren immuuncellen in menselijk bloed en het is bekend dat ze een belangrijke rol spelen bij infectie en ontsteking, omdat ze de eerste responders zijn die op de plaats van weefselbeschadiging aankomen1. In de afgelopen jaren is er een groeiende erkenning van de cruciale rol die neutrofielen spelen bij een verscheidenheid aan ziekten en bij het ondersteunen van homeostase2. Neutrofielen hebben niet alleen zelf een strak gereguleerde signalering, maar nemen ook deel aan de regulatie van andere componenten van het immuunsysteem 3,4,5. Daarom is het onderzoeken van neutrofielen en hun vele ongebruikelijke cellulaire functies, zoals chemotaxis, omgekeerde migratie6, fagocytose7, respiratoire uitbarsting8 en het vrijkomen van neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s)7, absoluut noodzakelijk in tal van onderzoekscontexten waar het noodzakelijk is om de potentiële neutrofiele functionele, morfologische of moleculaire veranderingen te beoordelen die worden veroorzaakt door specifieke omstandigheden die worden geanalyseerd.
Pas geïsoleerde neutrofielen zijn terminaal gedifferentieerd, kortlevend, zeer dynamisch en gemakkelijk te activeren9. Een efficiënte opslagmethode die geen invloed heeft op de neutrofielenresponsen is echter nog niet bereikt, waardoor het een uitdaging is om meerdere tests uit te voeren die ononderbroken moeten zijn. Bovendien zijn eerder beschreven functionele analyses 10,11, gebaseerd op tests die cytometrie en/of fluorescerende kleuring vereisen, mogelijk geen haalbare keuze wanneer een brede en eerste evaluatie van de neutrofielen nodig is.
Om deze problemen aan te pakken, beschrijft dit protocol een reeks tests die kunnen worden uitgevoerd na een enkel isolatieproces, waaronder de evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen, de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), real-time migratie en fagocytose van Saccharomyces cerevisiae, waarvan de resultaten kunnen worden gebruikt om diepgaande vervolgstudies te redeneren. Deze procedure, NeutroFun Screen genaamd, is ontworpen om de belangrijkste effectoractiviteiten te omvatten, behalve degranulatie, en kan worden voltooid in een gemiddelde tijd van 4 uur, inclusief 1 uur activering. Bovendien kunnen de resterende cellen worden gebruikt voor meer gedetailleerde benaderingen zoals omics-studies. Het voordeel van deze methode ligt in de balans tussen snelheid, volledigheid, kosten en nauwkeurigheid.
Bovendien is er een manier om gemakkelijk een voorlopige suggestie van NET waar te nemen, zonder specifieke markers, maar voldoende om aan te geven of verdere inspanningen in die richting de moeite waard zouden zijn. De diversiteit aan geteste functies is bedoeld om gemeenschappelijke punten tussen tests te combineren, waardoor de analysetijd en -kosten worden verminderd. Het belangrijkste doel van deze methode is om een evenwichtige, functionele analyse te bieden met betrekking tot snelheid, volledigheid, kosten en nauwkeurigheid die een overzicht mogelijk maakt van de respons van de neutrofielen, waardoor het een nuttige eerste stap is in het onderzoeken van de effecten van nieuwe stimuli op neutrofielen met normale dichtheid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neutrofielen zijn zeer dynamische en responsieve cellen die van korte duur zijn en nog niet kunnen worden gecryopreserveerd19, waardoor onderzoek naar hun biologie een uitdaging is. Daarom is het essentieel om zorgvuldige stappen te volgen om levensvatbare, verrijkte en rustende neutrofielen te verkrijgen 11,20. Deze studie maakte gebruik van een op dichtheid gebaseerde isolatietechniek die de nadruk legt op zachte en minimale manipulatie,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de volgende financieringsinstanties: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP en FINATEC.
Materials
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma – Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma – Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma – Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma – Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma – Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma – Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma – Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma – Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
- Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345 (2017).
- Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
- Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147 (2019).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
- El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
- Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
- Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770 (2021).
- Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
- Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
- Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
- Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
- Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
- Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991 (2021).
- Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41 (2019).
- Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316 (2019).
- Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
- Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153 (2019).
- Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
- Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637 (2021).
- Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
- Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
- Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
- Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
- Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106 (2021).
- Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27 (2021).
- Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582 (2020).
- Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
- Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
- Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
- Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
- Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
- Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
- Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790 (2020).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
- Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825 (2021).
- Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
- Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).
