Summary

تقييم الاستجابة المناعية للقاح مساعد مستحلب نانوي ضد عدوى المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA)

Published: September 01, 2023
doi:

Summary

يعد البروتوكول الحالي ويقيم الخصائص الفيزيائية والاستجابة المناعية والتأثير الوقائي في الجسم الحي للقاح مساعد مستحلب نانوي جديد.

Abstract

جذبت اللقاحات المساعدة للمستحلب النانوي اهتماما واسعا بسبب صغر حجم الجسيمات واستقرارها الحراري العالي وقدرتها على تحفيز استجابات مناعية صحيحة. ومع ذلك ، فإن إنشاء سلسلة من البروتوكولات الشاملة لتقييم الاستجابة المناعية للقاح مساعد مستحلب نانوي جديد أمر حيوي. لذلك ، تحتوي هذه المقالة على إجراء صارم لتحديد الخصائص الفيزيائية والكيميائية للقاح (عن طريق المجهر الإلكتروني النافذ [TEM] ، ومجهر القوة الذرية [AFM] ، وتشتت الضوء الديناميكي [DLS]) ، واستقرار مستضد اللقاح والنظام (عن طريق اختبار الطرد المركزي عالي السرعة ، واختبار الاستقرار الديناميكي الحراري ، و SDS-PAGE ، واللطخة الغربية) ، والاستجابة المناعية المحددة (IgG1 ، IgG2a و IgG2b). باستخدام هذا النهج ، يمكن للباحثين تقييم دقيق للتأثير الوقائي للقاح مساعد مستحلب نانوي جديد في نموذج فأر MRSA252 قاتل. باستخدام هذه البروتوكولات ، يمكن تحديد مساعد اللقاح النانوي الواعد من حيث إمكانات المساعدة الفعالة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تساعد الطرق في تحسين اللقاحات الجديدة للتطوير المستقبلي.

Introduction

المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA) هي أحد مسببات الأمراض الانتهازية مع واحدة من أعلى معدلات الإصابة في أجنحة وحدة العناية المركزة(ICU) 1 وأقسام أمراض القلب وأقسام الحروق في جميع أنحاء العالم. تظهر MRSA معدلات عالية من العدوى والوفيات ومقاومة واسعة للأدوية ، مما يمثل صعوبات كبيرة في العلاج السريري2. في قائمة الأولويات العالمية للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية الصادرة عن منظمة الصحة العالمية (WHO) في عام 2017 ، تم إدراج MRSA في الفئة3 الأكثر أهمية. لذلك هناك حاجة ماسة إلى لقاح ضد عدوى MRSA.

تم استخدام مادة الألومنيوم المساعدة لفترة طويلة ، والآلية المساعدة المساعدة واضحة نسبيا وآمنة وفعالة وجيدة التحمل4. المواد المساعدة الألومنيوم هي حاليا نوع من المواد المساعدة المستخدمة على نطاق واسع. يعتقد عموما أن المستضدات الممتصة على جزيئات ملح الألومنيوم يمكن أن تحسن الاستقرار وتعزز قدرة موقع الحقن على امتصاص المستضدات ، مما يوفر امتصاصا جيدا وإطلاقا بطيئا5. في الوقت الحالي ، يتمثل العيب الرئيسي للمواد المساعدة المصنوعة من الألومنيوم في أنها تفتقر إلى تأثير مساعد أو تظهر فقط تأثيرا مساعدا ضعيفا على بعض المستضدات المرشحة للقاح6. بالإضافة إلى ذلك ، تحفز المواد المساعدة المصنوعة من الألومنيوم تفاعلات فرط الحساسية بوساطة IgE5. لذلك ، من الضروري تطوير مواد مساعدة جديدة لتحفيز استجابة مناعية أقوى.

المواد المساعدة للمستحلب النانوي هي أنظمة تشتت غروية تتكون من الزيت والماء والمواد الخافضة للتوتر السطحي والمواد الخافضة للتوتر السطحي7. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المواد المساعدة مستقرة ديناميكيا حراريا ومتباينة الخواص ، ويمكن تعقيمها أو تثبيتها عن طريق الطرد المركزي عالي السرعة ، ويمكن تشكيلها تلقائيا في ظل ظروف تحضير معتدلة. العديد من المواد المساعدة للمستحلب (مثل MF59 ، سلسلة NB001-002 ، سلسلة AS01-04 ، إلخ) موجودة حاليا في السوق أو في مرحلة البحث السريري ، لكن أحجام جسيماتها أكبر من 160 نانومتر8. لذلك ، لا يمكن استغلال مزايا المستحضرات الطبية النانوية (1-100 نانومتر) (أي مساحة سطح محددة كبيرة ، وحجم الجسيمات الصغير ، وتأثير السطح ، والطاقة السطحية العالية ، وتأثير الحجم الصغير ، وتأثير الأنفاق الكمومية الكلية) بشكل كامل. في البروتوكول الحالي ، تم الإبلاغ عن مادة مساعدة جديدة تعتمد على تقنية المستحلب النانوي بحجم قطر 1-100 نانومتر لإظهار نشاط مساعد جيد9. اختبرنا بروتين مستضد لقاح الوحدة الفرعية لإعادة التركيب HI (α-hemolysin mutant [Hla] وعامل تحديد سطح أيون الحديد B [IsdB] الوحدة الفرعية N2 بروتين اندماج الشظايا النشط) ؛ تم وضع سلسلة من الإجراءات لفحص الخصائص الفيزيائية والاستقرار ، وتقييم استجابة الأجسام المضادة المحددة بعد الإعطاء العضلي ، واختبار التأثير الوقائي للقاح باستخدام نموذج العدوى الجهازية للفئران.

Protocol

أجريت التجارب على الحيوانات بناء على دليل استخدام ورعاية التجارب وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية وأخلاقيات المختبر التابعة للجامعة الطبية العسكرية الثالثة. تم استخدام إناث الفئران Balb / c ، بعمر 6-8 أسابيع ، في هذه الدراسة. تم الحصول على الحيوانات من مصادر تجارية (انظر جدول المواد</…

Representative Results

تم تقييم بروتوكول تحضير اللقاح المساعد للمستحلب النانوي والاختبارات المختبرية وفي الجسم الحي لهذا اللقاح. تم استخدام TEM و AFM و DLS لتحديد الخصائص المهمة لجهد زيتا وحجم الجسيمات على سطح هذه العينة (الشكل 1). أظهر SDS-PAGE والنشاف الغربي أن كمية المستضد في المادة المترسبة…

Discussion

يلعب IsdB ، وهو بروتين سطحي مثبت على جدار الخلية البكتيرية وينظمه الحديد ، دورا مهما في عملية الحصول على حديدالهيم 15. Hla ، سم ألفا ، هو من بين السموم البكتيرية الأكثر فعالية المعروفة في MRSA ، ويمكن أن تشكل المسام في الخلايا حقيقية النواة وتتداخل مع الالتصاق والخلايا الظه…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من قبل رقم 2021YFC2302603 من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين ، ورقم 32070924 و 32000651 من NSFC ، ورقم 2019jcyjA-msxmx0159 من برنامج مشروع مؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغتشينغ.

Materials

5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 Eppendorf, Germany  5424000495
96-well plates Corning Incorporated, USA CLS3922
AFM Dimension FastScan BRUKER, Germany  null
Alcohol lamp Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China YBS-AA-11408
Balb/c mice  Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. 
BCIP/NBT Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China BCIP/NBT
Bio-Rad 6.0 microplate reader Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA null
BL21 Competent Cell Merck millipore,Germany 70232-3CN
BSA-100G Sigma-Aldrich, USA B2064-100G
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
Coomassie bright blue G-250 staining solution MIKX,China DB236
Decolorization solution BOSTER,China AR0163-2
Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China null
Electrophoresis apparatus Beijing Liuyi Instrument Factory, China DYCZ-25D
Gel image Tanon, USA null
Glutathione-Sepharose Resin GST Mei5bio,China affinity chromatography resin
H2SO4 Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China 7664-93-9
HI recombinant protein Third Military Medical University,China 110-27-0
HRP -Goat Anti-Mouse IgG Biodragon, China BF03001
HRP- Goat anti-mouse IgG1 Biodragon, China BF03002R
HRP- Goat anti-mouse IgG2a Biodragon, China BF03003R
HRP- Goat anti-mouse IgG2b Biodragon, China BF03004R
Inoculation loop Haimen Feiyue Co.,LTD,China YR-JZH-1UL
IsdB and Hla clones Shanghai Jereh Biotechnology Co,China null
Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) SEPPIC, France null
isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside fdbio,China FD3278-1
LB bouillon culture-medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-136
Lnfrared physiotherapy lamp Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China 7600
Low temperature refrigerated centrifuge Eppendorf, Germany  null
Malvern NANO ZS Malvern Instruments Ltd., UK null
MH(A) medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-051
MH(B) medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-052
Micro plate washing machine 405 LSRS Bio Tek Instruments,Inc Highland  Park,USA null
Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China 1658030
MMC packing TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD 0022818
MRSA252 USA, ATCC null
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo Scientific, USA null
New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit DAKEWE, China 8012011
PBS biosharp, China null
PCR, Amplifier Thermal Cycler, USA null
pGEX-target gene recombinant plasmid Shanghai Jereh Biotechnology Co,China B3528G
Phosphotungstic acid G-CLONE, China CS1231-25g
pipette Eppendorf, Germany  3120000844
polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) Aladdin, China K400327-1kg
Primary antibody Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera null See Reference 11 for details
propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) Sigma-Aldrich, USA P4347-500ML
Protein Marker Thermo Scientufuc, USA 26616
PVDF TRANSFER MEMBRANE Invitrogen,USA 88518
Scanning Electron Microscope JEOL,Japan JSM-IT800
Sodium pentobarbital Merck,Germany Tc-P8411
Talos L120C TEM Thermo Fisher, USA null
TMB color solution TIAN GEN, China PA107-01
Turtle kits Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD ES80545
Tween-20 Macklin, China 9005-64-5

References

  1. Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
  2. Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
  3. Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
  4. Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
  5. Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
  6. Geoghegan, S., O’Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
  7. Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
  8. Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
  9. Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
  10. Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
  11. Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
  12. National Pharmacopoeia Committee. . Chinese Pharmacopoeia. , 1088 (2020).
  13. Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
  14. Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
  15. Roy, U., Kornitzer, D. Heme-iron acquisition in fungi. Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).
  16. Saeed, K., et al. Bacterial toxins in musculoskeletal infections. Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).
  17. Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
  18. Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
  19. Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
  20. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
  21. Francis, M. J. Recent advances in vaccine technologies. The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).
  22. Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
  23. Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
  24. Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).

Play Video

Cite This Article
Zeng, X., Sun, H., Ye, Y., Luo, X., Cai, D., Yang, Y., Chen, T., Sun, C., Zhang, S., Zeng, H. Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Infection. J. Vis. Exp. (199), e65152, doi:10.3791/65152 (2023).

View Video