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환경과학

Quantification et caractérisation du génome entier de l’ARN du SRAS-CoV-2 dans les eaux usées et les échantillons d’air

Published: June 30, 2023
doi:
10.3791/65053
, , , , , , , , ,
1Institute of Sustainable Processes,University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology,University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology,National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS – School of Medicine and Biomedical Sciences,Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit),Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

Ce protocole vise à quantifier l’ARN du SRAS-CoV-2 dans les eaux usées et les échantillons d’air destinés à être utilisés pour des études épidémiologiques basées sur les eaux usées et à évaluer le risque d’exposition au SRAS-CoV-2 dans les aérosols intérieurs et extérieurs. Ce protocole décrit également une approche de séquençage à matrice longue d’amplicon en mosaïque pour la caractérisation du génome entier du SRAS-CoV-2.

Abstract

L’épidémiologie basée sur les eaux usées est apparue comme un système de surveillance prometteur et efficace du SRAS-CoV-2 et d’autres maladies infectieuses dans de nombreux pays. Le processus implique généralement la concentration des eaux usées, l’extraction d’acides nucléiques, l’amplification de segments génomiques sélectionnés, ainsi que la détection et la quantification du segment génomique amplifié. Cette méthodologie peut également être utilisée pour détecter et quantifier les agents infectieux, tels que le SRAS-CoV-2, dans les échantillons d’air. Initialement, on a présumé que le SRAS-CoV-2 se propageait principalement par contact personnel étroit avec des gouttelettes générées par une personne infectée en parlant, en éternuant, en toussant, en chantant ou en respirant. Cependant, un nombre croissant d’études ont signalé la présence d’ARN du SRAS-CoV-2 dans l’air des établissements de santé, établissant la transmission par voie aérienne comme une voie viable pour le virus. Cette étude présente un ensemble de protocoles établis pour faciliter la détection, la quantification et le séquençage des virus dans l’environnement à partir d’échantillons d’eaux usées et d’air.

Introduction

En décembre 2019, une nouvelle maladie appelée COVID-19 est apparue, causée par un coronavirus jusque-là inconnu, le SRAS-CoV-21. La pandémie mondiale qui en a résulté a représenté un défi de taille pour les laboratoires cliniques et de santé publique du monde entier, car un grand nombre de personnes ont besoin de tests pour évaluer avec précision la transmission et la prévalence du virus dans la communauté. Cependant, dans de nombreuses régions, il est économiquement impossible d’atteindre le niveau nécessaire de tests en temps opportun et de manière spatialement complète 2,3. Les systèmes de surveillance actuels, basés sur des diagnostics cliniques individuels, dépendent fortement de la gravité des symptômes et de la déclaration individuelle, ainsi que de la mesure dans laquelle ces symptômes se chevauchent avec les maladies existantes circulant dans la population 4,5,6,7,8,9,10. Par conséquent, un nombre élevé de cas asymptomatiques contribue à une sous-estimation significative de la charge de morbidité 7,11.

En raison de ces défis, l’épidémiologie basée sur les eaux usées (WBE) pour la surveillance de la COVID-19 a été proposée comme stratégie de surveillance complémentaire. Le WBE a été décrit pour la première fois en 200112 et a d’abord été utilisé pour retracer la cocaïne et d’autres drogues illégales13. Cette approche repose sur l’hypothèse qu’il est possible de calculer la concentration initiale de toute substance stable dans les eaux usées et excrétée par l’homme 8,12. WBE a été mis en œuvre avec succès dans de nombreux pays en tant que système de surveillance complémentaire et efficace du SRAS-CoV-2 3,8,14,15,16. La majorité des méthodes de détection des virus humains en milieu aquatique suivent les étapes suivantes : concentration, extraction des acides nucléiques, amplification du ou des segments génomiques choisis, et détection/quantification du segment génomique amplifié3.

Un autre environnement important pour la détection et la quantification du SRAS-CoV-2 est celui des échantillons d’air. Initialement, on pensait que le SRAS-CoV-2 se transmettait principalement par contact personnel étroit avec des gouttelettes respiratoires provenant d’aérosols générés par une personne infectée en parlant, en éternuant, en toussant, en chantant ou en respirant17. Cependant, plusieurs études ont commencé à signaler la présence d’ARN du SRAS-CoV-2 dans l’air, en particulier dans les établissements de santé et autres espaces clos 18,19,20,21. Des preuves de viabilité du SRAS-CoV-2 dans des échantillons d’air prélevés à l’intérieur des hôpitaux et d’autres espaces clos ont été trouvées lorsque la concentration du virus était suffisamment élevée22,23,2 4. Les études en plein air n’ont généralement trouvé aucune preuve de la présence du SRAS-CoV-2, sauf dans les espaces extérieurs bondés 21,25,26,27,28,29. À l’heure actuelle, la transmission aérienne du SRAS-CoV-2 a été reconnue comme un mode de transmission30,31. Une étude récente montre les différences entre l’extérieur, où les risques de transmission par voie aérienne sont minimes à l’extérieur des zones surpeuplées, et l’intérieur, où des risques plus importants pourraient être présents dans des environnements mal ventilés dans lesquels des sources fortes (c’est-à-dire le nombre de personnes infectées) pourraient être présentes. Une étude approfondie récente a mis en évidence les différences substantielles entre les risques de transmission par voie aérienne dans les environnements extérieurs et intérieurs, en particulier dans les zones surpeuplées où la ventilation est faible. L’étude indique que le risque de transmission par voie aérienne est minime dans les environnements extérieurs, où il y a un plus grand volume d’air disponible pour la dilution et la dispersion des particules virales32. Ces résultats ont des implications importantes pour les politiques et les directives de santé publique liées à la COVID-19. En reconnaissant les différences significatives dans les risques de transmission entre les environnements intérieurs et extérieurs, les décideurs peuvent élaborer des stratégies plus efficaces pour atténuer la propagation du virus et protéger la santé publique.

Il existe une variété de méthodes et de protocoles pour la détection, la quantification et le séquençage du SRAS-CoV-2 à partir de différents échantillons environnementaux. Cet article sur la méthode vise à présenter une combinaison de protocoles bien établis qui permettent à des laboratoires ayant différents niveaux de capacité d’effectuer la détection, la quantification et le séquençage environnementaux des virus à partir d’échantillons d’eaux usées et d’air.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été publiées ailleurs et contiennent de petites modifications par rapport aux méthodes originales. 1. Collecte des eaux usées et prétraitement des échantillons REMARQUE : En raison des faibles concentrations d’ARN du SRAS-CoV-2 dans les échantillons environnementaux, la mise en œuvre d’une étape de concentration est cruciale pour une détection réussie33,34,35<sup…

Representative Results

Les résultats résumés dans le tableau 3 montrent des exemples de détection et de quantification de l’ARN du SRAS-CoV-2 dans des échantillons d’eaux usées et d’air à l’aide de la méthode décrite dans cet article. Des échantillons d’eaux usées ont été prélevés dans des stations d’épuration en Espagne et en Slovénie et ont été considérés comme positifs si le Ct était inférieur à 40 dans au moins deux des trois répétitions, la quantification étant considérée comme val…

Discussion

La détection et la quantification microbiennes et virales à l’aide de méthodes de (RT-)qPCR ont été largement acceptées en raison de leur sensibilité remarquable. Cependant, ces techniques se heurtent à de nombreux défis lors de l’analyse d’échantillons environnementaux. Les échantillons d’eaux usées contiennent une abondance de substances inhibitrices qui peuvent fausser les mesures et générer des résultats trompeurs. Pour remédier à ces limitations et améliorer la précision, un protocole comp…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été réalisé avec le soutien financier du gouvernement régional de Castille-et-León et du programme FEDER (projets CLU 2017-09, UIC315 et VA266P20).

Materials

Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit
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References

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Gonçalves, J., Gomes da Silva, P., Koritnik, T., Bosilj, M., Torres-Franco, A., Diaz, I., Rodriguéz, E., Marcos, E., Mesquita, J. R., García-Encina, P. Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples. J. Vis. Exp. (196), e65053, doi:10.3791/65053 (2023).
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