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환경과학

Cuantificación y caracterización del genoma completo del ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire

Published: June 30, 2023
doi:
10.3791/65053
, , , , , , , , ,
1Institute of Sustainable Processes,University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology,University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology,National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS – School of Medicine and Biomedical Sciences,Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit),Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

Este protocolo tiene como objetivo cuantificar el ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire para ser utilizado en estudios epidemiológicos basados en aguas residuales y evaluar el riesgo de exposición al SARS-CoV-2 en aerosoles interiores y exteriores. Este protocolo también describe un enfoque de secuenciación de plantilla larga de amplicón en mosaico para la caracterización del genoma completo del SARS-CoV-2.

Abstract

La epidemiología basada en las aguas residuales se ha convertido en un sistema de vigilancia prometedor y eficaz para el SARS-CoV-2 y otras enfermedades infecciosas en muchos países. El proceso suele implicar la concentración de aguas residuales, la extracción de ácidos nucleicos, la amplificación de segmentos genómicos seleccionados y la detección y cuantificación del segmento genómico amplificado. De manera similar, esta metodología se puede aprovechar para detectar y cuantificar agentes infecciosos, como el SARS-CoV-2, en muestras de aire. Inicialmente, se suponía que el SARS-CoV-2 se propagaba principalmente a través del contacto personal cercano con gotitas generadas por una persona infectada al hablar, estornudar, toser, cantar o respirar. Sin embargo, un número creciente de estudios han informado de la presencia de ARN del SARS-CoV-2 en el aire de los centros sanitarios, estableciendo la transmisión aérea como una ruta viable para el virus. Este estudio presenta una combinación de protocolos establecidos para facilitar la detección, cuantificación y secuenciación ambiental de virus a partir de muestras de aguas residuales y aire.

Introduction

En diciembre de 2019, surgió una nueva enfermedad llamada COVID-19, causada por un coronavirus previamente desconocido, el SARS-CoV-21. La pandemia mundial resultante ha presentado un desafío significativo para los laboratorios clínicos y de salud pública en todo el mundo, ya que un gran número de personas requieren pruebas para evaluar con precisión la transmisión y prevalencia del virus en la comunidad. Sin embargo, en muchas regiones, alcanzar el nivel necesario de pruebas de manera oportuna y espacialmente exhaustiva es económicamente inviable 2,3. Los sistemas de vigilancia actuales, basados en el diagnóstico clínico individual, dependen en gran medida de la gravedad de los síntomas y de la notificación individual, así como de la medida en que estos síntomas se solapan con las enfermedades existentes que circulan en la población 4,5,6,7,8,9,10. En consecuencia, un elevado número de casos asintomáticos contribuye a una subestimación significativa de la carga de enfermedad 7,11.

Debido a estos desafíos, se propuso la epidemiología basada en aguas residuales (WBE, por sus siglas en inglés) para la vigilancia de la COVID-19 como una estrategia de vigilancia complementaria. El WBE se describió por primera vez en 200112, y se utilizó inicialmente para rastrear cocaína y otras drogas ilegales13. Este enfoque se basa en la suposición de que es posible calcular la concentración inicial de cualquier sustancia que sea estable en las aguas residuales y excretada por los seres humanos 8,12. WBE se ha implementado con éxito en muchos países como un sistema de vigilancia complementario y eficiente para el SARS-CoV-2 3,8,14,15,16. La mayoría de los métodos para detectar virus humanos en ambientes acuáticos siguen estos pasos: concentración, extracción de ácidos nucleicos, amplificación del segmento (o segmentos) genómicos elegidos y detección/cuantificación del segmento genómico amplificado3.

Otro entorno importante para la detección y cuantificación del SARS-CoV-2 es en muestras de aire. Inicialmente, se pensaba que el SARS-CoV-2 se transmitía principalmente a través del contacto personal cercano con gotitas respiratorias de aerosoles generados por una persona infectada al hablar, estornudar, toser, cantar o respirar17. Sin embargo, varios estudios comenzaron a relatar la presencia de ARN del SARS-CoV-2 en el aire, especialmente en establecimientos de salud y otros espacios cerrados 18,19,20,21. Se han encontrado evidencias de viabilidad del SARS-CoV-2 en muestras de aire tomadas en interiores de hospitales y otros espacios cerrados cuando la concentración del virus era lo suficientemente alta22,23,2 4. En general, los estudios al aire libre no han encontrado evidencia de SARS-CoV-2, excepto en espacios al aire libre concurridos 21,25,26,27,28,29. Hasta el momento, la transmisión aérea del SARS-CoV-2 ha sido reconocida como un modo de transmisión30,31. Un estudio de revisión reciente muestra las diferencias entre el aire libre, donde los riesgos de transmisión aérea son mínimos fuera de las áreas concurridas, y el interior, donde los riesgos más grandes podrían estar presentes en entornos mal ventilados en los que podría haber fuentes fuertes (es decir, el número de personas infectadas). Un reciente estudio de revisión exhaustiva ha puesto de relieve las diferencias sustanciales entre los riesgos de transmisión aérea en entornos exteriores frente a interiores, especialmente en zonas concurridas con poca ventilación. El estudio indica que el riesgo de transmisión aérea es mínimo en ambientes exteriores, donde existe un mayor volumen de aire disponible para la dilución y dispersión de partículas virales32. Estos hallazgos tienen implicaciones importantes para las políticas y directrices de salud pública relacionadas con la COVID-19. Al reconocer las diferencias significativas en los riesgos de transmisión entre ambientes interiores y exteriores, los responsables de la formulación de políticas pueden desarrollar estrategias más eficaces para mitigar la propagación del virus y proteger la salud pública.

Existe una variedad de métodos y protocolos para la detección, cuantificación y secuenciación del SARS-CoV-2 a partir de diferentes muestras ambientales. Este artículo de método tiene como objetivo presentar una combinación de protocolos bien establecidos que permiten a los laboratorios con diferentes niveles de capacidad realizar la detección, cuantificación y secuenciación ambiental de virus a partir de muestras de aguas residuales y aire.

Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido publicados en otros lugares y contienen pequeñas modificaciones con respecto a los métodos originales. 1. Recogida de aguas residuales y preprocesamiento de muestras NOTA: Debido a las bajas concentraciones de ARN del SARS-CoV-2 en muestras ambientales, la implementación de un paso de concentración es crucial para una detección exitosa33,34,35<s…

Representative Results

Los resultados resumidos en la Tabla 3 muestran ejemplos de detección y cuantificación de ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire utilizando el método descrito en este artículo. Las muestras de aguas residuales se recogieron en plantas de tratamiento de aguas residuales de España y Eslovenia y se consideraron positivas si el Ct era inferior a 40 en al menos dos de las tres réplicas, considerándose válida la cuantificación si el Ct tenía una variación inferior al 5%. En Españ…

Discussion

La detección y cuantificación microbiana y viral mediante métodos de (RT-)qPCR ha obtenido una amplia aceptación debido a su notable sensibilidad. Sin embargo, estas técnicas se enfrentan a numerosos retos a la hora de analizar muestras ambientales. Las muestras de aguas residuales contienen una gran cantidad de sustancias inhibidoras que pueden sesgar las mediciones y generar resultados engañosos. Para hacer frente a estas limitaciones y mejorar la precisión, se concibió, diseñó e implementó un protocolo comp…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo se ha realizado con el apoyo financiero de la Junta de Castilla y León y del programa FEDER (proyectos CLU 2017-09, UIC315 y VA266P20).

Materials

Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit
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References

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Gonçalves, J., Gomes da Silva, P., Koritnik, T., Bosilj, M., Torres-Franco, A., Diaz, I., Rodriguéz, E., Marcos, E., Mesquita, J. R., García-Encina, P. Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples. J. Vis. Exp. (196), e65053, doi:10.3791/65053 (2023).
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