Оптимизация процесса пробоподготовки для просвечивающей электронной микроскопии нервно-мышечных соединений личинок дрозофилы
Summary
В этом отчете представлена новая процедура подготовки образцов для визуализации нервно-мышечных соединений у личинок дрозофилы . Этот метод более эффективен в предотвращении скручивания образцов по сравнению с традиционным методом и особенно полезен для ультраструктурного анализа нервно-мышечного соединения дрозофилы .
Abstract
Нервно-мышечное соединение дрозофилы (NMJ) стало ценной модельной системой в области нейробиологии. Применение конфокальной микроскопии в Drosophila NMJ позволяет исследователям получать синаптическую информацию, охватывающую как количественные данные о распространенности синапсов, так и подробное понимание их морфологии. Тем не менее, диффузное распределение и ограниченный визуальный диапазон ПЭМ создают проблемы для ультраструктурного анализа. В этом исследовании представлен инновационный и эффективный метод пробоподготовки, который превосходит традиционный подход. Процедура начинается с помещения металлической сетки в основание бутылки или пробирки с плоским дном, после чего на сетку помещаются неподвижные образцы личинок. Дополнительная сетка помещается поверх образцов, гарантируя, что они расположены между двумя сетками. Неподвижные образцы тщательно обезвоживаются и инфильтрируются перед началом процедуры закладки. Затем встраивание образцов в эпоксидную смолу выполняется методом плоского листа, что позволяет подготовить мышцы к позиционированию и рассечению. Благодаря этим шагам все мышцы личинок дрозофилы могут быть визуализированы с помощью световой микроскопии, что облегчает последующее позиционирование и разделение. Избыток смолы удаляется после локализации6-й и7-й мышц сегментов тела А2 и А3. Проводится серийное ультратонкое сечение6-й или7-й мышцы.
Introduction
Электронная микроскопия является одним из самых идеальных методов изучения ультраструктуры биологических материалов, способных наглядно и точно продемонстрировать внутреннюю структуру клеток нананомасштабе1. Однако из-за сложности процесса пробоподготовки и высокой стоимости электронная микроскопия не так популярна, как световая микроскопия. Последние достижения в области методов электронной микроскопии привели к значительному улучшению качества изображения, что совпало со значительным снижением связанной с этим рабочей нагрузки. Следовательно, электронная микроскопия взяла на себя важную роль в развитии научных знаний в различных областях2.
Дрозофила является отличной животной моделью для выполнения генетических манипуляций с целью точного контроля пространственной и временной экспрессии генов-мишеней. Кроме того, дрозофила имеет преимущества короткого периода роста и легкого выращивания по сравнению с моделями млекопитающих; поэтому дрозофила широко используется в морфологических исследованиях 4,5.
У личинок дрозофилы бутоны нервно-мышечного перехода (NMJ) широко распространены в мышцах 6,7, и иммуноокрашивание NMJ может легко предоставить информацию о количестве и морфологии синапсов 8,9 . Бутоны NMJ, расположенные в6-й/7-й мышцах сегментовА2 иА3, хорошо подходят для количественных и морфологических исследований с помощью световой микроскопии. Это связано с их размерами и обилием 10,11. Таким образом, NMJ для личинок дрозофилы считаются полезной моделью для исследований в области нейробиологии12.
Тем не менее, наблюдать ультраструктуру бутонов NMJ с помощью ПЭМ сложно. Поскольку окно сканирования просвечивающей электронной микроскопии узкое, трудно расположить широко распространенные NMJ boutons13. Другая причина заключается в том, что стенка тела дрозофилы подвержена скручиванию во время стадии обезвоживания алкоголя по протоколу подготовки образца7.
В традиционных исследованиях обычно выбирали бутоны между6-й и7-й мышцами сегментовА2 иА3 в качестве образцового материала из-за их обилия и размера14,15. 6-я и7-я мышцы сегментовА2 иА3 больше других мышц и содержат больше бутонов. Однако при подготовке образцов для электронной микроскопии неподвижные образцы имели тенденцию становиться тонкими и склонными к скручиванию, что приводило к неправильному расположению6-й и7-й мышц сегментовА2 иА3.
Настоящим мы сообщаем о новой процедуре обработки, которая является более эффективной в предотвращении скручивания образцов по сравнению с традиционным методом подготовки образцов 7,16, позволяя образцам оставаться плоскими во время последующего обезвоживания, тем самым способствуя лучшему позиционированию нервно-мышечных соединений личинок дрозофилы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Образцы личинок дрозофилы имеют тенденцию сворачиваться во время обезвоживания, так как образцы тонкие, что затрудняет точное определение местоположения нервно-мышечного соединения, тем самым увеличивая сложность и рабочую нагрузку на подготовку образцов. Традиционное усоверш?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фондом естественных наук Китая Grant 32070811 и Фондом аналитических испытаний Юго-Восточного университета (Китай) 11240090971. Мы благодарим Лабораторию электронной микроскопии и Центр морфологического анализа Школы медицины Юго-Восточного университета, Нанкин, Китай.
Materials
| 1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating Agent |
| Drosophila Stocks | Bloomington | none | The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods |
| Flat-bottomed glass test tubes | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper) |
| K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula |
| K4M resin (monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Resin Monomer |
| Polyvinyl film | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm |
| SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Succinic Anhydride |
| SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Accelerator |
| SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Hardner for Epoxy |
| SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Resin Monomer |
| Steel mesh | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Copper or stainless steel net |
| Transmission electron microscopy | Hitachi H-7650 | 11416692 | All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy. |
| Ultrathin microtome | Leica UC7 ultrathin microtome | 595915 | All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife |
References
- Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Winans, N. J., et al. A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria. Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).
- Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
- Cardona, A., et al. An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy. PLoS Biology. 8 (10), (2010).
- Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction. Cell Reports. 34 (7), 108753 (2021).
- Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions. Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).
- Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction. Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19 (2020).
- Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).
- Ashley, J., et al. Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons. Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).
- Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions. Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- McCabe, B. D., et al. The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction. Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).
- Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy. Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. Journal of Visualized Experiments. (24), e1107 (2009).
- Lovrić, J., et al. Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS. Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).
- Woods, P. S., Ledbetter, M. C. Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope. Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).
- Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).
- Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability. Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).
- Zhang, X., et al. Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction. Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).
- Wu, S., et al. A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila. Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).
- Gan, G., Lv, H., Xie, W. Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil. PLoS One. 9 (8), 105497 (2014).
