Drosophila 유충의 신경근 접합부의 투과 전자 현미경을 위한 시료 전처리 공정 최적화
Summary
이 보고서는 Drosophila Larvae의 신경근 접합부를 시각화하기 위한 새로운 샘플 준비 절차를 제공합니다. 이 방법은 기존 방법에 비해 샘플의 말림을 방지하는 데 더 효과적이며 초파리 신경근 접합부 초구조 분석에 특히 유용합니다.
Abstract
초파리 신경근 접합부(NMJ)는 신경과학 분야에서 가치 있는 모델 시스템으로 부상했습니다. Drosophila NMJ에 컨포칼 현미경을 적용하면 연구자들은 시냅스 풍부도에 대한 정량적 데이터와 시냅스 형태에 대한 자세한 통찰력을 모두 포함하는 시냅스 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나 TEM의 확산 분포와 제한된 가시 범위는 초구조 해석에 어려움을 초래합니다. 이 연구는 기존 접근 방식을 능가하는 혁신적이고 효율적인 샘플 준비 방법을 소개합니다. 이 절차는 바닥이 평평한 병이나 시험관의 바닥에 금속 메쉬를 놓은 다음 고정된 유충 샘플을 메쉬 위에 놓는 것으로 시작됩니다. 추가 메쉬가 샘플 위에 배치되어 두 메쉬 사이에 배치되도록 합니다. 고정 샘플은 임베딩 절차를 진행하기 전에 완전히 탈수되고 침투됩니다. 그런 다음 에폭시 수지에 샘플을 매립하는 것은 평평한 시트 방식으로 수행되어 위치 지정 및 절편을 위한 근육을 준비할 수 있습니다. 이러한 단계를 통해 Drosophila 유충의 모든 근육을 광학 현미경으로 시각화할 수 있어 후속 위치 지정 및 절편을 용이하게 할 수 있습니다. 과도한 수지는 신체 분절 A2 및 A3의 6번째 및 7번째 근육을 찾은 후 제거됩니다. 6번째 또는 7번째 근육의 연속적인 초박형 절편이 수행됩니다.
Introduction
전자 현미경은 나노 단위 레벨1에서 세포의 내부 구조를 시각적이고 정확하게 보여줄 수 있는 생물학적 물질의 미세 구조를 연구하는 가장 이상적인 방법 중 하나입니다. 그러나 시료 전처리 공정의 복잡성과 높은 비용으로 인해 전자 현미경은 광학 현미경만큼 인기가 없습니다. 최근 전자 현미경 기술의 발전으로 이미지 품질이 크게 향상되었으며, 이와 동시에 관련 작업 부하가 눈에 띄게 감소했습니다. 결과적으로 전자 현미경은 다양한 분야의 과학 지식을 발전시키는 데 중요한 역할을 하게 되었습니다2.
Drosophila는 표적 유전자의 공간적, 시간적 발현을 정밀하게 제어하기 위한 유전자 조작을 수행하기 위한 우수한 동물 모델이다3. 게다가, Drosophila는 포유류 모델에 비해 성장 기간이 짧고 사육이 용이하다는 장점이 있습니다. 따라서 Drosophila는 형태학 연구에서 널리 사용됩니다 4,5.
초파리 유충에서 신경근 접합부(NMJ) 부톤은 근육에 널리 분포되어 있으며(6,7), NMJ의 면역염색은 시냅스의 양과 형태에 대한 정보를 쉽게 제공할 수 있다 8,9 . A2 및 A3 분절의 6/7근육에 위치한 NMJ 부톤은 광학 현미경을 사용한 정량적 및 형태학적 연구에 매우 적합합니다. 이것은 그들의 크기와 풍부함 때문이다10,11. 따라서 초파리 유충 NMJ는 신경과학 연구에 유용한 모델로 간주된다12.
그러나 TEM으로 NMJ bouton 초미세구조를 관찰하는 것은 어렵습니다. 투과 전자 현미경의 스캔 창은 좁기 때문에 널리 분포된 NMJ boutons13을 배치하기가 어렵습니다. 또 다른 이유는 초파리(Drosophila ) 체벽이 시료 전처리 프로토콜7의 알코올 탈수 단계에서 말릴 수 있기 때문이다.
전통적인 연구는 일반적으로 A2 및 A3 세그먼트의 6번째와 7번째 근육 사이의 boutons를 풍부하고 크기14,15 때문에 샘플 재료로 선택했습니다. A2 및 A3 세그먼트의 6번째 및 7번째 근육은 다른 근육보다 크고 더 많은 부톤을 포함합니다. 그러나 전자 현미경을 위해 샘플을 준비할 때 고정 샘플은 얇아지고 말리기 쉬워 A2 및 A3 세그먼트의 6번째 및 7번째 근육의 부적절한 위치로 이어졌습니다.
이로써 우리는 후속 탈수 동안 샘플이 평평하게 유지되도록 함으로써 Drosophila 유충 신경근 접합부의 더 나은 위치 지정을 용이하게 함으로써 기존 샘플 준비 방법 7,16에 비해 샘플의 말림을 방지하는 데 더 효과적인 새로운 처리 절차를 보고합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila 유충 샘플은 샘플이 얇기 때문에 건조 중에 말리는 경향이 있어 신경근 접합부를 정확하게 찾기 어렵고 이로 인해 샘플 준비의 어려움과 작업량이 증가합니다. 전통적인 개선은 샘플7을 줄이는 것이지만 샘플은 여전히 다른 정도로 말려 있습니다.
우리의 방법에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다: 첫째, 샘플은 금속 메쉬의 제한으로 인해 탈?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국자연과학재단(Natural Science Foundation of China) 보조금 32070811와 동남대학교(중국) 분석 테스트 기금(Southeast University(China) Analysis Test Fund 11240090971)의 지원을 받았습니다. 중국 난징에 있는 동남대학교 의과대학 전자현미경 연구소 및 형태학적 분석 센터에 감사드립니다.
Materials
| 1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating Agent |
| Drosophila Stocks | Bloomington | none | The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods |
| Flat-bottomed glass test tubes | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper) |
| K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula |
| K4M resin (monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Resin Monomer |
| Polyvinyl film | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm |
| SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Succinic Anhydride |
| SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Accelerator |
| SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Hardner for Epoxy |
| SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Resin Monomer |
| Steel mesh | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Copper or stainless steel net |
| Transmission electron microscopy | Hitachi H-7650 | 11416692 | All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy. |
| Ultrathin microtome | Leica UC7 ultrathin microtome | 595915 | All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife |
References
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