监测斑马鱼幼虫的靶向信号反应 - Z-REX 揭示亲电药物和代谢物的精确机制

康奈尔大学（美国）的斑马鱼饲养和处理程序按照美国国立卫生研究院 （NIH） 的指导方针进行，并得到机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。瑞士洛桑联邦理工学院（瑞士洛桑联邦理工学院）斑马鱼部门的斑马鱼饲养和处理程序是根据《动物福利法》SR 455和动物福利条例SR 455.1进行的，并获得了州兽医授权VD-H23。 注意：在该协议中， Tg（lyz：TagRFP ）和 Tg（mpeg1：EGFP） 鱼系表达Halo-TeV-Keap1用于证明Z-REX。该方法可以扩展到其他感兴趣的蛋白质、转基因报告鱼系和下游生物测定。有关本研究中使用的缓冲液，请参阅 补充表1 。所有试剂、仪器、设备、抗体、质粒、斑马鱼菌株和设备均列在 材料表中。 1. 信使核糖核酸制备 使用 mMessage mMachine SP6 体外 转录试剂盒制备 Halo-TeV-Keap1-2xHA 和 Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA mRNA。注意：按照制造商的说明对每个mRNA进行40μL规模的反应。将 mRNA 沉淀重新溶解在 10 μL 无核酸酶水中。 评估mRNA质量并通过微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳测量浓度。高质量的 mRNA 应具有大约2.0 或高于 2.0 的 A 260/A280 比率。 用无核酸酶的水将 mRNA 稀释至 1-1.5 mg/mL。 等分mRNA溶液（每管1-2μL），并将等分试样储存在-80°C。 2. 生产鱼胚 选项1：生产野生型（WT）鱼胚胎。在10个单独的水箱中设置10对鱼，每个水箱在雄鱼和雌性亲鱼之间包含一个分隔器。注意：总共10个交叉对通常为测定提供足够数量的胚胎。杂交对的数量可以根据实验设计/需要和亲鱼的繁殖力进行调整。 第二天早上，设置喷油器后，拆下五个水箱中的分隔器。等待30分钟让鱼交配。 将亲鱼移动到另一个水箱中，通过将水箱水通过过滤器来收集胚胎，然后将过滤器中的胚胎冲洗到10厘米的培养皿中。这些胚胎将用于第一轮注射。注意：如果某个批次的卵子质量差（例如，由于蛋白质聚集，鸡蛋不透明），不要将它们与其他胚胎合并。 （可选）在其他五个储罐上执行步骤2.1.2-2.1.3中所述的类似程序以进行下一轮注射。注意：最好只进行一轮注射，以尽量减少胚胎之间的年龄差异。但是，如果需要的胚胎多于一个批次可以注射的胚胎，建议进行两轮注射，以确保胚胎在mRNA注射期间保持在1-4细胞阶段。注射轮数可根据操作人员的注射技能和实验设计进行调整。但是，建议在2小时内执行整个过程（从去除第一个分隔器到注射最后一个胚胎）。胚胎之间的年龄差异很大可能会损害实验结果的可靠性和可重复性。 选项2：产生杂合子转基因中性粒细胞/巨噬细胞报告鱼胚胎。在10个单独的水箱中设置10个鱼交叉对，每个水箱在雄性和雌性亲鱼之间插入一个分隔器：WT鱼与Tg（lyz：TagRFP）或WT鱼与Tg（mpeg1：eGFP）。注意：避免杂合转基因鱼之间的杂交，这可能会影响下游荧光读数，因为与杂合鱼相比，纯合子报告鱼显示出更高的荧光信号。转基因报告系和WT胚胎在成像时很容易区分。在同一池中混合WT和杂合胚胎不是问题。 lyz：TagRFP 报告中性粒细胞， mpeg：eGFP 报告巨噬细胞。该协议也可以应用于其他报告鱼系。 按照步骤 2.1.2-2.1.4 操作。 3. 微量注射器设置 打开气源，将背压设置为 0.2-0.5 psi，并将注射压力设置为 25-30 psi。通常建议使用所示的特定压力范围。注意：必须有稳定的背压，以防止鱼介质回流到针中。在步骤3.8中校准进样体积时，仅应更改进样时间。不要在以下步骤中改变注射压力;由于表面和界面张力，低注射压力会导致注射失败，而高注射压力会损坏胚胎。 用RNase去污溶液清洁设备和注射平台。注意：降解mRNA的RNase可能来自操作员或设备。有必要在实验前进行清理，并戴上手套。 （可选）如果共注射 mRNA 和吗啉素，请将两者在 0.2 mL 管中预混合。注意：Z-REX通过使用浓度为250-1500ng / μL的Halo-TeV-Keap1-2xHA mRNA溶液效果很好。斑马鱼中也使用了几种吗啉诺，据报道最佳浓度为7。如果使用具有未发表序列的吗啉诺，操作人员应首先评估吗啉诺的毒性和基因敲低效率，然后再将其用于Z-REX中。 将 1-2 μL mRNA（和/或吗啉诺，如适用7）转移到带有微量装载器移液器吸头的进样针中。注意：如果使用火焰/棕色微量移液器拉拔器制备针头，则设置如下。热量：520个单位;拉力：60单位;速度：70个单位;延迟：155个单位;压力：550单位;坡道：530个单位。 将针头安装在显微注射机械手上。注意：来自空气源的背压应将mRNA（/吗啉）溶液推到针尖。 使用锋利的镊子或剃须刀片折断针尖，形成适合注射的开口。 将针尖浸入载物台千分尺上的矿物油中。 施加两次或三次注射脉冲以去除尖端中的气泡。 通过改变注射时间将液滴大小校准为 2 nL。注意：最好通过将沉积在血细胞计数器上的矿物油（模拟卵黄囊的粘度）来执行此操作。使用显微镜，使用血细胞计数器的网格线估计注射过程中形成的液滴的大小，并相应地调整注射时间。尽管有时使用酚红染料，但尚未观察到此处描述的mRNA注射过程中对它的需求。 4. 显微注射 用新鲜的10%汉克平衡盐溶液（HBSS）培养基填充注射板，并用钝钳将胚胎对准板的凹槽中。注意：注射板在10%HBSS培养基中用2%琼脂糖制备;凹槽是用塑料模具形成的。 将针尖浸入注射板中的10%HBSS培养基中。 施加两次或三次注射脉冲以去除尖端中的气泡。 对于每次注射，一次移动穿透绒毛膜和卵黄囊并施加注射脉冲。注射后，这种注入的液体可以立即看到蛋黄囊内的小球体。这个小球体消散相对较快。对其他胚胎重复此步骤，直到获得足够数量的注射胚胎。注意：胚胎（注射和非注射）的存活率通常在50%-90%之间变化。目标是注射每个对照/实验组所需胚胎数量的两倍。在生物素下拉测定中，每种情况需要100-140个活胚胎。在qRT-PCR测定中，每种情况推荐五个活胚胎。活鱼成像和全安装免疫荧光染色测定的样本量是用户定义的;建议每种情况下至少有20个活胚胎，以便在分析中产生良好的统计功效。 将注射的胚胎冲洗到含有新鲜10%HBSS培养基的新10厘米培养皿中。注意：胚胎可以使用喷瓶轻松地从凹槽中冲洗出来。 将未注射的胚胎汇集到另一个板中。注意：根据需要，未注射的胚胎可以作为鱼的健康，基线蛋白质表达，背景荧光水平等的质量控制。如果注射程序效果良好，并且注射的mRNA /吗啉诺对胚胎不致命，则注射和非注射胚胎应具有相似的活力。 5. Z-霸王龙 根据实验设置（即对照/实验组的数量），将注射的胚胎分配到10厘米的培养皿中。 在具有红光照明的暗室中，用 30 mL 的 10% HBSS 替换培养基，含或不含 1 μM Ht-PreHNE（炔烃）。注意：Ht-PreHNE（炔烃）是一种光不稳定的化合物。在以下步骤中，胚胎应被蒙在鼓里。 在黑暗中将胚胎在28.5°C孵育。 在 30.5 hpf 的暗室中，用新鲜的 30 mL 10% HBSS 替换培养基。注：更换介质时，请尽可能多地取出旧介质。这对于从胚胎中去除未结合/过量的Ht-PreHNE（炔烃）至关重要。 将胚胎在28.5°C的黑暗中孵育30分钟。 再重复步骤 5.4-5.5 两次。 打开紫外灯（365nm，3mW/cm2）5分钟以预热灯。注意：灯预热步骤必须在步骤5.8之前执行。灯功率在打开后的最初几分钟内较低/不稳定。灯的功率应定期用紫外线计测量。 在 32 hpf 下，将胚胎暴露在紫外线下。选项 1：对于下游读数，例如活鱼成像、全卡口免疫荧光染色、凝胶内荧光分析（与 Cy5 叠氮化物点击偶联）、RNA-seq 或 qRT-PCR，将胚胎暴露在紫外线下 3 分钟，每 30 秒旋转一次板。 选项2：对于下游读数，例如生物素下拉测定，将胚胎暴露在紫外线下最多5分钟（最少3分钟），每30秒旋转一次板，并将板在冰上冷却1分钟。注意：如果使用不同的探头，则需要优化曝光时间，具体取决于给定的光笼式亲电试剂探头和部署的光源的光解笼的t 1/2。t1/2光解笼可以使用已知程序8确定。对于Ht-PreHNE（炔烃），t1/2<1分钟3;因此，上述指示的时间就足够了。 6. 下游检测 选项1：表型测定。转基因中性粒细胞/巨噬细胞报告基因的实时成像鱼线，Tg（lyz：TagRFP）和Tg（mpeg1：eGFP）（图2）通过在4°C孵育10分钟来麻醉胚胎。注意：建议每种情况下至少有20个活胚胎。 从平板上取出未受精/死亡的胚胎。注意：未受精/死亡的胚胎是混浊的/不透明的，可以目视识别。如果发现高死亡率，请检查注射程序或尝试降低mRNA或吗啉诺的浓度。 用锋利的镊子去皮胚。用一对镊子握住绒毛膜，不要接触幼鱼，用另一对镊子撕掉绒毛膜。胚胎是脆弱的。仅在进行去皮屑时触摸绒毛膜。注意：在去皮质过程中损坏一些胚胎是很常见的，尤其是在初学者中。因此，总是有更多的胚胎超过所需的最小数量。 将胚胎安装在2%琼脂糖平板（用10%HBSS培养基制备）上，并用体视显微镜（明场和相应的荧光通道）对胚胎进行成像（图2A，C，G）。注意：在Z-REX [卤素-TeV-Keap1-2xHA mRNA注射和Ht-PreHNE（炔烃）处理的组合]后，发现中性粒细胞（lyz：TagRFP）的消耗在36 hpf（Z-REX后4小时）最显着，而巨噬细胞（mpeg1：eGFP）的减少在34 hpf（Z-REX后2小时）最显着（图2E，F）。如果使用不同的报告基因系、mRNA/吗啉或探针，则可以使用其他时间点。曝光时间和/或增益必须优化，以可视化单个细胞或所需的特定（超）结构。 通过ImageJ（NIH）计数每条鱼的中性粒细胞/巨噬细胞数量（图2B，D-F，H）。使用 ImageJ 中的手绘选择工具圈出整条鱼，并使用选项“查找千里马”对荧光细胞进行计数。 备选办法2：目标标签评估。生物素叠氮化物点击偶联和生物素下拉测定（图3)通过在4°C下孵育麻醉胚胎。 这通常需要 10 分钟。注意：为了获得足够的鱼裂解物，每种情况都需要100-140个活胚胎。 从平板上取出未受精/死亡的胚胎。 进行去皮和去阳糖。通过用一对锋利的镊子握住绒毛膜，用另一对镊子穿透卵黄囊，然后在取出绒毛膜的同时分离蛋黄囊以使蛋黄蛋白出来来进行这两种操作。注意：在此步骤中去除蛋黄蛋白至关重要。样品中丰富的卵黄蛋白会干扰以后的分析。 将脱脂胚胎转移到 1.5 mL 管中。注意：旋转板以将脱脂胚胎居中，这有助于收集。在此过程中，较轻的绒毛膜碎屑会消失。 胚胎稳定到管底后，除去上清液，并加入 1 mL 冷却的 HEPES 缓冲盐水 （pH 7.6）。 再重复步骤 6.2.5 两次。 （可选）如果不打算立即进行下一步，请取出缓冲液，将样品快速冷冻在液氮中，并将其储存在-80°C。注意：脱黄鱼丸可以在液氮中快速冷冻并储存在-80°C。 速冻样品可在-80°C下储存长达2周。 将鱼丸重悬于裂解缓冲液中。注意：裂解缓冲液（pH 7.6）由50 mM HEPES，100 mM NaCl，1%Triton X-100,0.3 mM TCEP，2x 罗氏完全迷你无EDTA蛋白酶抑制剂和来自大豆的0.1 mg / mL胰蛋白酶抑制剂组成。一个胚胎产生约2μg裂解物。每 120 个胚胎使用 100 μL 裂解缓冲液。使用前应将两种罗氏 cOmplete Mini 不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂和来自大豆的胰蛋白酶抑制剂添加到裂解缓冲液中。 在管中加入 20% v/v 氧化锆珠。 涡旋20秒，在液氮中快速冷冻，并在37°C水浴中解冻。 再重复步骤 6.2.10 两次。 将溶液在4°C下以21,000× g 离心10分钟。 将上清液转移到新的预冷 1.5 mL 管中。 通过布拉德福德测定法测量蛋白质浓度。 将裂解物稀释至 1 mg/mL。 对于每种情况，将 170 μg 裂解物转移到 2 mL 管中。 将步骤6.2.16中的裂解物与0.2mg / mL TeV蛋白酶（S219V）混合，并将溶液在37°C孵育30分钟。注意：对于非TeV蛋白酶处理的组，只需将裂解物与其他组中使用的TeV蛋白酶溶液等体积的裂解缓冲液混合即可。 为生物素-叠氮化物点击反应准备 10x 预混液：10% w/v SDS、10 mM CuSO4、1 mM Cu（TBTA）、1 mM 生物素叠氮化物和 20 mM TCEP。注意：在步骤 6.2.19 之前将 TCEP 添加到混合物中。 将 8.5 μL t-BuOH 和 17 μL 10x 点击反应预混液添加到步骤 6.2.17 中的（TeV 蛋白酶消化）裂解物中。涡旋，离心，并将溶液在37°C孵育15分钟。 向溶液中加入另外1mM TCEP，然后涡旋，离心，并将溶液在37°C下再孵育15分钟。步骤6.2.19-6.2.20的孵育时间总共为30分钟。注意：TCEP的这种补充，一种用于生成Cu（I）的还原试剂，可提高点击反应效率。 向每个试管中加入 600 μL -20 °C 乙醇，涡旋溶液，并在 -80 °C 下孵育过夜。注意：样品可以在-80°C下储存1周;如果没有，请立即继续执行下一步。 将溶液在4°C下以21,000× g 离心1小时。注意：离心后应在管底部形成沉淀，这是所需的部分。 除去上清液，加入1mL的-20°C乙醇，涡旋，并将溶液在4°C下以21,000× g 离心10分钟。 重复步骤 6.2.23。 除去上清液，加入1mL的-20°C丙酮，涡旋，并将溶液在4°C下以21,000× g 离心10分钟。 除去上清液。让多余的残留丙酮蒸发，但不能完全变干。 将沉淀重悬于 100 μL 重悬缓冲液（8% w/v 十二烷基硫酸锂 [LDS]，1 mM EDTA 在 50 mM HEPES 盐水中，pH 7.6）中，涡旋 15 秒，超声处理直至沉淀溶解。 在室温（RT）下以21,000× g 离心溶液5分钟。 将上清液转移到新的 2 mL 管中，并加入 1.5 mL 的 50 mM HEPES 盐水，pH 7.6。注意：此步骤中LDS的最终浓度为0.5%。较高的LDS浓度可能会破坏下拉效率。因此，尽管增加LDS浓度可以帮助减少非特异性结合，但它也可能降低下拉的效率。因此，建议不要在此步骤中改变LDS浓度。 收集“输入”样品（图 3）：将 30 μL 1 mg/mL 裂解物转移到新的 1.5 mL 管中，并加入 10 μL 含有 6% β-巯基乙醇 （BME） 的 4x Laemmli 样品缓冲液。快速冷冻溶液，并将其储存在-80°C。 将 100 μL 床体积链霉亲和素高容量树脂转移到新的 2 mL 管中。在50mM HEPES盐水（pH 7.6）中加入1mL的0.5%LDS，在室温下以1,500× g 离心2分钟，并除去上清液。用另外 1 mL 的 0.5% LDS 在 50 mM HEPES 盐水 （pH 7.6） 中重复洗涤。 将步骤6.2.29中的溶液转移到含有步骤6.2.31预洗的链霉亲和素高容量树脂的管中，并将溶液在室温下在端对端混合器上孵育4-6小时。 将混合物在室温下以 1,500 x g 离心 2 分钟，取 30 μL 上清液，并将其与 10 μL 含有 6% BME 的 4x Laemmli 样品缓冲液混合，用于“流通”样品。然后，除去剩余的上清液。注意：“流通”样品可以通过蛋白质印迹分析，以检查链霉亲和素下拉效率。必须尽可能多地去除上清液以洗掉未结合的蛋白质。首先，使用 P-1000 移液器去除大部分上清液，然后使用带有凝胶上样吸头的 P-20 移液器去除剩余的上清液。 向树脂中加入 1 mL 的 0.5% LDS 在 50 mM HEPES 盐水 （pH 7.6） 中，并将混合物在室温下孵育 30 分钟，并端到端旋转。 将混合物在室温下以1,500× g 离心2分钟，并除去上清液。注意：通常，0.5%LDS足以去除大多数非特异性结合蛋白。如果在以后的分析中仍然看到非特异性结合信号，则可以增加洗涤缓冲液中的LDS浓度。 再重复步骤 6.2.34-6.2.35 两次。 向树脂中加入 40 μL 含有 6% BME 的 2x Laemmli 样品缓冲液。 通过将混合物在98°C孵育5分钟来洗脱结合的蛋白质。 将混合物在室温下以 21,000 x g 离心 5 分钟，并将上清液转移到新的 1.5 mL 管中。这是“洗脱”样品。注意：将含有步骤6.2.38中树脂的溶液直接加载到凝胶中可能会影响SDS-PAGE分析。 将 20 μL 加载到 10 泳道 10% 聚丙烯酰胺凝胶的每个孔中，并进行凝胶电泳。注意：以较低的电压（120 V）运行凝胶，直到染料前沿到达分离凝胶，并将电压更改为170 V.染料前沿出来后停止程序。 使用抗HA、抗晕或其他抗体进行蛋白质印迹，检测管家蛋白（图3）。 选项3：转录组学分析。RNA-seq 和 qRT-PCR（图 4）注意：强烈建议使用彼此相距15分钟内放置的胚胎进行此测定。胚胎的年龄差异显着影响测定结果。通过在Z-REX后在4°C孵育10分钟，2小时来麻醉胚胎。 用锋利的镊子进行去皮（步骤6.1.3）。 （可选）如果要单独分析不同的节段，则用镊子进行分割（例如，将头部与尾部分开）。 如果从整个胚胎中提取RNA，则将三到五个胚胎转移到1.5 mL管中。如果从头部或尾部提取RNA，则将10-12个解剖片段转移到1.5 mL管中。注意：建议进行三到五个生物学重复的实验。 向管中加入 1 mL TRIzol 试剂和玻璃珠。注意：发现玻璃珠比氧化锆珠在RNA提取方面效果更好。 涡旋混合物30秒。注意：如果不立即进行下一步，溶液可以在-80°C下储存1-3周。 根据制造商的说明提取RNA。 通过微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳评估RNA质量和浓度。注意：质量好的RNA应具有A260 / A280 的比例约为或高于2.0。 要么提交RNA进行测序，要么用扩增级DNase I处理1μgRNA，并使用上标III逆转录酶和寡核苷酸-（dT）20进行逆转录。根据制造商的说明执行此步骤。 执行qRT-PCR并通过ΔΔCT方法9分析数据（图4B-D）。 选项4：POI表达和共定位分析。全卡口免疫荧光染色测定（图5）注意：甲醛固定胚胎是脆弱的。避免剧烈摇晃，并小心处理。按照步骤6.1.1-6.1.3对胚胎进行去皮。 将胚胎转移到 1.5 mL 管中。注意：每个试管应具有相同数量的胚胎，并且不超过40个胚胎。 胚胎沉降到管底部后，除去上清液，并加入 1 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （pH 7.6）。 再次重复步骤 6.4.3。 除去上清液，在PBS（pH 7.6）中加入1mL的4%甲醛，并将试管在4°C下轻轻摇动孵育过夜。注意：甲醛溶液中的样品可以在4°C下储存1周。 除去上清液，加入1mL-20°C甲醇，并将管在其侧面在-20°C孵育至少18小时。注意：样品可以在-20°C下储存1个月或更长时间。 除去上清液，加入 1 mL PDT 缓冲液（PBS 缓冲液中的 0.3% v/v Triton X-100、0.1% v/v 吐温-20 和 1% v/v 二甲基亚砜 [DMSO]）。 重复步骤6.4.7，并在室温下轻轻摇动管孵育管30分钟。 取出上清液，加入 1 mL 封闭缓冲液（10% v/v 热灭活胎牛血清 [FBS]、2% w/v 牛血清白蛋白 [BSA] 和 0.1% v/v 吐温-20 在 PBS 缓冲液中），并将试管在室温下温育 1 小时，轻轻摇动。 除去上清液，加入 200 μL 一抗溶液（在封闭缓冲液中稀释）。 取出上清液，加入500μL一抗溶液（在封闭缓冲液中稀释），并将试管在4°C下轻轻摇动孵育过夜。注意：如果使用新的一抗，则值得包括一些没有一抗染色的样品作为阴性对照。然而，理想情况下，吗啉基敲低或工程基因敲除胚胎，或靶蛋白表达受到刺激的胚胎，是验证抗体的更可靠手段。 取出上清液，加入 1 mL PDT 缓冲液，并在室温下轻轻摇动管孵育管 30 分钟。 重复步骤 6.4.12。 取出上清液，加入 1 mL 封闭缓冲液，并在室温下轻轻摇动管孵育管 1 小时。注意：此步骤后，应保护样品避光，以防止二抗上偶联的荧光团发生光漂白。 除去上清液，加入 200 μL 二抗溶液（在封闭缓冲液中稀释）。 取出上清液，加入 500 μL 二抗溶液（在封闭缓冲液中稀释），并将管在室温下温育 1.5 小时，轻轻摇动。 取出上清液，加入 1 mL PDT 缓冲液，并在室温下轻轻摇动管孵育管 30 分钟。 重复步骤 6.4.17。 将胚胎安装在2%琼脂糖板上（用PBS，pH 7.6制成），并用体视显微镜（明场和相应的荧光通道）对胚胎进行成像（图5A，B，D，F）。注意：如果使用徕卡M165 FC荧光体视显微镜，请使用25倍的放大倍率以获得分辨率良好的图像。 通过ImageJ（NIH）量化/分析荧光信号强度。使用 ImageJ 中的 手绘选择 工具量化感兴趣区域中的信号。