Мониторинг целевых сигнальных реакций у личинок рыбок данио-рерио - Z-REX раскрывает точные механизмы электрофильных препаратов и метаболитов

Процедуры разведения и обработки рыбок данио-рерио в Корнельском университете (США) проводились в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения (NIH) и одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC). Процедуры содержания и обработки рыбок данио-рерио в подразделении рыбок данио-рерио Швейцарского федерального технологического института в Лозанне (EPFL, Швейцария) выполнялись в соответствии с Законом о защите животных SR 455 и Постановлением о защите животных SR 455.1 с кантональным ветеринарным разрешением VD-H23. ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе для демонстрации Z-REX используются рыбные линии Tg( lyz:TagRFP) и Tg(mpeg1:EGFP), экспрессирующие Halo-TeV-Keap1. Метод может быть распространен на другие интересующие белки, трансгенные репортерные рыбные линии и последующие биологические анализы. Дополнительные буферы, использованные в этом исследовании, см. в Дополнительной таблице 1 . Все реагенты, инструменты, оборудование, антитела, плазмиды, штаммы рыбок данио-рерио и оборудование перечислены в Таблице материалов. 1. Подготовка мРНК Подготовьте мРНК Halo-TeV-Keap1-2xHA и Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA с помощью набора для транскрипции mMessage mMachine SP6 in vitro .ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям производителя и выполняйте реакции в масштабе 40 мкл для каждой мРНК. Повторно растворите гранулу мРНК в 10 мкл воды, не содержащей нуклеаз. Оцените качество мРНК и измерьте концентрацию с помощью микрообъемного спектрофотометра и электрофореза в агарозном геле. МРНК хорошего качества должна иметь соотношение A260/A280 около или выше 2,0. Разбавьте мРНК до 1-1,5 мг/мл водой, не содержащей нуклеаз. Аликвотируйте раствор мРНК (1-2 мкл на пробирку) и храните аликвоты при -80 ° C. 2. Производство эмбрионов рыб Вариант 1: Получение эмбрионов рыб дикого типа (WT).Установите 10 пар скрещивания рыб в 10 отдельных резервуарах, каждый из которых содержит разделитель между самцом и самкой родительской рыбы.ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности 10 скрещивающихся пар обычно обеспечивают достаточное количество эмбрионов для анализов. Количество скрещивающихся пар может быть скорректировано в соответствии с планом/потребностью эксперимента и плодовитостью родительской рыбы. На следующее утро, после настройки инжектора, снимите разделители в пяти баках. Подождите 30 минут, пока рыба спарится. Переместите родительскую рыбу в другой резервуар, соберите эмбрионы, пропустив воду из аквариума через ситечко, а затем промойте эмбрионы из ситечка в 10-сантиметровую чашку Петри. Эти эмбрионы будут использоваться для первого раунда инъекций.ПРИМЕЧАНИЕ: Если качество яиц из определенной партии низкое (например, яйца непрозрачны из-за агрегации белков), не объединяйте их с другими эмбрионами. (Необязательно) Выполните аналогичные процедуры, описанные в этапах 2.1.2-2.1.3, на остальных пяти резервуарах для следующего раунда впрыска.ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего выполнять только один раунд инъекций, чтобы свести к минимуму разницу в возрасте между эмбрионами. Однако, если требуется больше эмбрионов, чем может быть введено в одной партии, рекомендуется выполнить два раунда инъекции, чтобы гарантировать, что эмбрионы остаются на стадии 1-4 клеток во время инъекции мРНК. Количество впрыскных патронов можно регулировать в соответствии с навыками впрыска оператора и дизайном эксперимента. Тем не менее, рекомендуется выполнить всю процедуру (от удаления первого делителя до инъекции последнего эмбриона) в течение 2 часов. Большая разница в возрасте между эмбрионами может ухудшить надежность и воспроизводимость результатов эксперимента. Вариант 2: Получение гетерозиготных трансгенных эмбрионов рыб-репортеров нейтрофилов/макрофагов.Установите 10 пар скрещивания рыб в 10 отдельных резервуарах, в каждый из которых вставлен разделитель между самцами и самками родительских рыб: рыба WT против Tg (lyz: TagRFP) или рыба WT против Tg (mpeg1: eGFP).ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте скрещивания между гетерозиготными трансгенными рыбами, которые могут повлиять на флуоресцентные показания ниже по течению, поскольку гомозиготные рыбы-репортеры демонстрируют более высокий флуоресцентный сигнал по сравнению с гетерозиготными рыбами. Трансгенные репортерные линии и эмбрионы WT можно легко различить при визуализации. Наличие смеси WT и гетерозиготных эмбрионов в одном пуле не является проблемой. lyz:TagRFP сообщает о нейтрофилах, а mpeg:eGFP сообщает о макрофагах. Этот протокол может быть применен и к другим репортерским лескам. Выполните шаги 2.1.2-2.1.4. 3. Настройка микроинжектора Включите источник воздуха, установите противодавление на 0.2-0.5 фунтов на квадратный дюйм и установите давление впрыска на 25-30 фунтов на квадратный дюйм. Обычно рекомендуется определенный диапазон давления.ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно иметь стабильное противодавление, чтобы предотвратить обратный поток рыбной среды в иглу. При калибровке объема впрыска на шаге 3.8 следует изменять только время впрыска. Не изменяйте давление впрыска на следующих этапах; Низкое давление впрыска может привести к неудаче впрыска из-за поверхностного и межфазного натяжения, тогда как высокое давление впрыска может повредить эмбрионы. Очистите оборудование и платформу для впрыска раствором для обеззараживания РНКазы.ПРИМЕЧАНИЕ: РНКаза, которая разлагает мРНК, может поступать от оператора или оборудования. Необходимо выполнить уборку перед экспериментом, и надеть перчатки. (Необязательно) При одновременном введении мРНК и морфолино предварительно смешайте их в пробирке объемом 0,2 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Z-REX хорошо работает при использовании раствора мРНК Halo-TeV-Keap1-2xHA с концентрацией 250-1500 нг/мкл. Несколько морфолино также использовались у рыбок данио, и сообщалось об оптимальных концентрациях7. При использовании морфолино с неопубликованной последовательностью оператор должен сначала оценить токсичность и эффективность нокдауна генов морфолино, прежде чем использовать его в Z-REX. Перенесите 1-2 мкл мРНК (и/или морфолино, если применимо7) в инъекционную иглу с помощью наконечника пипетки микрозагрузчика.ПРИМЕЧАНИЕ: При подготовке игл с помощью съемника микропипеток Flaming/Brown настройка следующая. Теплота: 520 единиц; прочность на тягу: 60 единиц; скорость: 70 единиц; задержка: 155 единиц; давление: 550 единиц; Рампа: 530 единиц. Установите иглу на микроинъекционный манипулятор.ПРИМЕЧАНИЕ: Противодавление от источника воздуха должно подталкивать раствор мРНК (/ морфолино) к кончику иглы. Используйте острые щипцы или лезвие бритвы, чтобы сломать кончик иглы, создав подходящее отверстие для инъекции. Погрузите кончик иглы в минеральное масло на ступенчатом микрометре. Нанесите два или три импульса впрыска, чтобы удалить пузырьки воздуха в наконечнике. Откалибруйте размер капли до 2 нл, изменив время впрыска.ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего это делать путем инъекции в минеральное масло (которое имитирует вязкость желточного мешка), наложенное на гемоцитометр. Используя микроскоп, используйте линии сетки гемоцитометра, чтобы оценить размер капли, образующейся во время инъекции, и соответствующим образом отрегулировать время инъекции. Хотя фенольный красный краситель иногда используется, необходимости в нем в описанной здесь процедуре инъекции мРНК не наблюдалось. 4. Микроинъекция Заполните инъекционную пластину свежей 10% средой сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) и выровняйте эмбрионы в канавках пластины тупыми щипцами.ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина для впрыска приготовлена из 2% агарозы в 10% среде HBSS; Бороздки формируются с помощью пластиковой формы. Погрузите кончик иглы в 10% среду HBSS в инъекционную пластину. Нанесите два или три импульса впрыска, чтобы удалить пузырьки воздуха в наконечнике. Для каждой инъекции проникают в хорион и желточный мешок одним движением и прикладывают инъекционный импульс. Эту впрыскиваемую жидкость можно увидеть сразу после инъекции в виде небольшого сфероида в желточном мешке. Этот маленький сфероид рассеивается относительно быстро. Повторите этот шаг для других эмбрионов до тех пор, пока не будет получено достаточное количество инъецированных эмбрионов.ПРИМЕЧАНИЕ: Выживаемость эмбрионов (как инъекционных, так и неинъекционных) обычно варьируется от 50% до 90%. Стремитесь ввести вдвое больше эмбрионов, необходимых для каждой контрольной/экспериментальной группы. В анализе вытягивания биотина для каждого состояния требуется 100-140 жизнеспособных эмбрионов. В анализе qRT-PCR для каждого состояния рекомендуется пять жизнеспособных эмбрионов. Размер выборки для визуализации живой рыбы и анализа иммунофлуоресцентного окрашивания на всю установку определяется пользователем; Рекомендуется иметь не менее 20 жизнеспособных эмбрионов для каждого состояния, чтобы получить хорошую статистическую мощность в анализе. Промойте введенные эмбрионы в новую 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую свежую 10% среду HBSS.ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы можно легко вымыть из бороздок с помощью бутылки для брызг. Объедините неинъецированные эмбрионы в другую пластину.ПРИМЕЧАНИЕ: Неинъецированные эмбрионы могут служить для контроля качества здоровья рыбы, базовой экспрессии белка, фоновых уровней флуоресценции и т. Д., По мере необходимости. Если процедура инъекции сработала хорошо, и введенная мРНК / морфолино не смертельна для эмбрионов, инъецированные и неинъекционные эмбрионы должны иметь одинаковую жизнеспособность. 5. З-РЕКС Распределите введенные эмбрионы по 10-сантиметровым чашкам в соответствии с установкой эксперимента (т.е. номерами контрольной/экспериментальной групп). В темном помещении с красным светом замените среду 30 мл 10% HBSS с 1 мкМ Ht-PreHNE (алкин) или без него.ПРИМЕЧАНИЕ: Ht-PreHNE (алкин) представляет собой легколабильное соединение. Эмбрионы следует держать в темноте в следующие этапы. Инкубируют эмбрионы при температуре 28,5 °C в темноте. При 30,5 л.с. в темном помещении замените среду свежими 30 мл 10% HBSS.ПРИМЕЧАНИЕ: При замене носителя удалите как можно больше старого носителя. Это имеет решающее значение для удаления несвязанного/избыточного количества Ht-PreHNE (алкина) из эмбрионов. Инкубируют эмбрионы при температуре 28,5 °C в темноте в течение 30 мин. Повторите шаги 5.4-5.5 еще два раза. Включите УФ-лампу (365 нм, 3 мВт/см2) на 5 минут, чтобы предварительно разогреть лампу.ПРИМЕЧАНИЕ: Этап предварительного прогрева лампы должен быть выполнен до шага 5.8. Мощность лампы ниже/нестабильна в первые несколько минут после включения. Мощность лампы следует регулярно измерять УФ-метром. При 32 hpf подвергните эмбрионы воздействию ультрафиолетового света.Вариант 1: Для последующих считываний, таких как визуализация живой рыбы, иммунофлуоресцентное окрашивание целиком, флуоресцентный анализ в геле (щелчок с азидом Cy5), РНК-секвенирование или qRT-PCR, подвергайте эмбрионы ультрафиолетовому излучению в течение 3 минут, вращая планшеты каждые 30 с. Вариант 2: Для последующих считываний, таких как анализ вытягивания биотина, подвергайте эмбрионы ультрафиолетовому излучению в течение максимум 5 минут (и минимум 3 минут), вращая пластины каждые 30 с, и охлаждайте пластины на льду в течение 1 минуты.ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании разных зондов необходимо оптимизировать время воздействия света в зависимости от t1/2 фотодекажа для данного электрофильного зонда в фотоклетке и развернутого источника света. T1/2фотодемонтажа можно определить с использованием известных методик8. Для Ht-PreHNE(алкина) t1/2 составляет < 1мин3; Таким образом, указанного выше времени достаточно. 6. Последующие анализы Вариант 1: Фенотипический анализ. Репортер трансгенных нейтрофилов/макрофагов в реальном временирыбные лески, Tg(lyz:TagRFP) и Tg(mpeg1:eGFP) (рис. 2)Обезболивают эмбрионы путем инкубации при 4 °C в течение 10 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется иметь не менее 20 жизнеспособных эмбрионов на одно условие. Удалите неоплодотворенные/мертвые эмбрионы из пластины.ПРИМЕЧАНИЕ: Неоплодотворенные/мертвые эмбрионы мутные/непрозрачные и могут быть визуально идентифицированы. Если наблюдается высокий уровень смертности, вернитесь к процедуре инъекции или попробуйте снизить концентрацию мРНК или морфолино. Дехорионируйте эмбрионы острыми щипцами. Держите хорион одной парой щипцов, не касаясь личинок рыбы, а другой парой щипцов оторвите хорион. Зародыш хрупкий. Прикасайтесь к хориону только при выполнении дехорионации.ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно, особенно у начинающих, некоторые эмбрионы повреждаются во время дехорионации. Поэтому всегда имейте больше эмбрионов, чем минимально необходимо. Установите эмбрионы на 2%-ную агарозную пластину (приготовленную с 10%-ной средой HBSS) и сфотографируйте эмбрионы с помощью стереомикроскопа (светлое поле и соответствующие флуоресцентные каналы) (рис. 2A, C, G).ПРИМЕЧАНИЕ: После Z-REX [комбинация инъекции мРНК Halo-TeV-Keap1-2xHA и лечения Ht-PreHNE (алкин)] было обнаружено, что истощение нейтрофилов (lyz: TagRFP) является наиболее значительным при 36 hpf (4 ч после Z-REX), тогда как снижение макрофагов (mpeg1: eGFP) было наиболее значительным через 34 hpf (2 ч после Z-REX) (рис. 2E, F). Другие моменты времени можно использовать при использовании разных репортерных линий, мРНК/морфолино или зондов. Время экспозиции и/или усиление должны быть оптимизированы для визуализации отдельных клеток или конкретных (ультра)структур желаемого. Подсчитайте количество нейтрофилов/макрофагов каждой рыбы с помощью ImageJ (NIH) (рис. 2B, D-F, H). Используйте инструмент «Выделение от руки» в ImageJ, чтобы обвести всю рыбу, и используйте опцию «Найти максимумы», чтобы подсчитать флуоресцентные ячейки. Вариант 2: Оценка целевой маркировки. Азидное соединение биотина и анализ вытягивания биотина (Рисунок 3)Анестезируют эмбрионы путем инкубации при 4 °C. Обычно это занимает 10 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить достаточное количество лизата рыбы, для каждого состояния требуется 100-140 жизнеспособных эмбрионов. Удалите неоплодотворенные/мертвые эмбрионы из пластины. Выполняют дехорионацию и дейоляцию. Выполните две манипуляции, удерживая хорион парой острых щипцов, используя другую пару щипцов, чтобы проникнуть в желточный мешок, а затем отделив желточный мешок, удалив хорион, чтобы белки желтка вышли.ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе очень важно удалить белки желтка. Обильные белки желтка в образце мешают последующему анализу. Перенесите дежелтованные эмбрионы в пробирку объемом 1,5 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Вращайте тарелку так, чтобы центрировать очищенные эмбрионы, что облегчает сбор. Более светлый мусор хориона отсеивается во время этого процесса. После того, как эмбрионы осядут на дно пробирки, удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл охлажденного физиологического раствора, буферизованного HEPES (pH 7,6). Повторите шаг 6.2.5 еще два раза. (Необязательно) Если вы не собираетесь немедленно переходить к следующему шагу, удалите буфер, заморозьте образцы в жидком азоте и храните их при температуре -80 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы рыбы, очищенные от желтка, можно мгновенно заморозить в жидком азоте и хранить при температуре -80 °C. Замороженные образцы можно хранить при температуре -80 °C до 2 недель. Ресуспендируйте рыбные гранулы в буфере лизиса.ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для лизиса (рН 7,6) состоит из 50 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 0,3 мМ TCEP, 2x ингибиторов протеазы Roche cOmplete Mini EDTA и 0,1 мг / мл ингибитора трипсина из соевых бобов. Один эмбрион дает около 2 мкг лизата. Используйте 100 мкл буфера лизиса на каждые 120 эмбрионов. Два ингибитора протеазы Roche cOmplete Mini EDTA и ингибиторы трипсина из соевых бобов следует добавлять в буфер лизиса непосредственно перед использованием. Добавьте в тюбик 20% шариков диоксида циркония v/v. Вихревая в течение 20 с, мгновенное замораживание в жидком азоте и размораживание на водяной бане при температуре 37 °C. Повторите шаг 6.2.10 еще два раза. Центрифугируют раствор при 21 000 x g при 4 °C в течение 10 мин. Перенесите надосадочную жидкость в новую, предварительно охлажденную пробирку объемом 1,5 мл. Измерьте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда. Разбавьте лизат до 1 мг/мл. Для каждого состояния перенесите 170 мкг лизата в пробирку объемом 2 мл. Смешайте лизат из шага 6.2.16 с 0,2 мг / мл протеазы TeV (S219V) и инкубируйте раствор при 37 ° C в течение 30 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Для групп, не получавших протеазу ТэВ, просто смешайте лизат с равным объемом буфера лизиса с раствором протеазы ТэВ, используемым в других группах. Приготовьте 10-кратную мастер-смесь для реакции клика биотин-азид: 10% мас./об. SDS, 10 мМ CuSO4, 1 мМ Cu (TBTA), 1 мМ биотин-азида и 20 мМ TCEP.ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте TCEP в смесь непосредственно перед шагом 6.2.19. Добавьте 8,5 мкл t-BuOH и 17 мкл 10-кратной смеси реакционной смеси к лизату (расщепленному протеазой ТэВ) на этапе 6.2.17. Встряхните, центрифугу и инкубируйте раствор при 37 °C в течение 15 мин. Добавьте в раствор еще 1 мМ TCEP, а затем вихревую центрифугу и инкубируйте раствор при 37 °C еще 15 мин. Общее время инкубации для этапов 6.2.19-6.2.20 составляет 30 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Эта добавка TCEP, восстанавливающего реагента для образования Cu (I), повышает эффективность реакции щелчка. Добавьте 600 мкл этанола -20 °C в каждую пробирку, встряхните раствор и инкубируйте его при -80 ° C в течение ночи.ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить при температуре -80 °C в течение 1 недели; Если нет, немедленно переходите к следующему шагу. Центрифугируют раствор при 21 000 x g при 4 °C в течение 1 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования на дне пробирки должна образоваться гранула, которая представляет собой желаемую фракцию. Удалите надосадочную жидкость, добавьте 1 мл этанола с температурой -20 °C, встряхните и центрифугируйте раствор при 21 000 x g при 4 °C в течение 10 мин. Повторите шаг 6.2.23. Удалите надосадочную жидкость, добавьте 1 мл ацетона с температурой -20 °C, встряхните и центрифугируйте раствор при 21 000 x g при 4 °C в течение 10 мин. Удалите надосадочную жидкость. Дайте избытку остаточного ацетона испариться, хотя и не полностью до сухости. Ресуспендируйте гранулу в 100 мкл буфера ресуспендирования (8% по массе додецилсульфата лития [LDS], 1 мМ ЭДТА в 50 мМ физиологического раствора HEPES, pH 7,6), вихревите в течение 15 с и обрабатывайте ультразвуком до тех пор, пока гранула не растворится. Центрифугируют раствор при 21 000 x g при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 2 мл и добавьте 1,5 мл физиологического раствора HEPES 50 мМ с pH 7,6.ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация СПД на этом этапе составляет 0,5%. Более высокие концентрации LDS могут подорвать эффективность вытягивания. Таким образом, хотя увеличение концентрации LDS может помочь уменьшить неспецифическое связывание, оно также может снизить эффективность вытягивания. Соответственно, рекомендуется не менять концентрацию СПД на этом этапе. Соберите «входной» образец (рис. 3): перенесите 30 мкл лизата 1 мг/мл в новую пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 10 мкл буфера для образца 4x Laemmli, содержащего 6% β-меркаптоэтанола (BME). Мгновенно заморозьте раствор и храните его при температуре -80 °C. Перенесите 100 мкл стрептавидиновой смолы большой емкости в новую пробирку объемом 2 мл. Добавьте 1 мл 0,5% LDS в 50 мМ физиологического раствора HEPES (рН 7,6), центрифугу при 1,500 x g при RT в течение 2 мин и удалите надосадочную жидкость. Повторите промывание с еще 1 мл 0,5% LDS в 50 мМ физиологического раствора HEPES (pH 7,6). Перенесите раствор со стадии 6.2.29 в пробирку, содержащую предварительно промытую смолу стрептавидина высокой емкости из стадии 6.2.31, и инкубируйте раствор на смесителе с концом при RT в течение 4-6 часов. Центрифугируйте смесь при 1,500 x g при RT в течение 2 мин, возьмите 30 мкл надосадочной жидкости и смешайте ее с 10 мкл буфера для образца 4x Laemmli, содержащего 6% BME для «проточной» пробы. Затем удалите остатки надосадочной жидкости.ПРИМЕЧАНИЕ: «Проточные» образцы могут быть проанализированы методом вестерн-блоттинга для проверки эффективности вытягивания стрептавидина. Важно удалить как можно больше надосадочной жидкости, чтобы вымыть несвязанные белки. Сначала удалите большую часть надосадочной жидкости с помощью пипетки P-1000, а затем удалите оставшуюся надосадочную жидкость с помощью пипетки P-20 с наконечником для загрузки геля. Добавьте 1 мл 0,5% LDS в 50 мМ физиологического раствора HEPES (pH 7,6) в смолу и инкубируйте смесь в течение 30 мин при RT с вращением из конца в конец. Центрифугируйте смесь при 1,500 x g при RT в течение 2 мин и удалите надосадочную жидкость.ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 0,5% LDS достаточно для удаления большинства неспецифических связывающих белков. Если неспецифические сигналы связывания все еще видны в более позднем анализе, концентрация LDS в буфере для промывки может быть увеличена. Повторите шаги 6.2.34-6.2.35 еще два раза. Добавьте в смолу 40 мкл 2x буфера для образцов Laemmli, содержащего 6% BME. Вытеснить связанные белки путем инкубации смеси при 98 °C в течение 5 мин. Центрифугируйте смесь при 21 000 x g при RT в течение 5 мин и перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 1,5 мл. Это и есть образец «элюции».ПРИМЕЧАНИЕ: Непосредственная загрузка раствора, содержащего смолу из этапа 6.2.38, в гель может повлиять на анализ SDS-PAGE. Загрузите 20 мкл в каждую лунку 10-полосного 10% полиакриламидного геля и запустите гель-электрофорез.ПРИМЕЧАНИЕ: Запускайте гель при более низком напряжении (120 В), пока фронт красителя не достигнет рассасывающего геля, и измените напряжение на 170 В. Остановите программу после того, как фронт красителя выйдет. Проведите вестерн-блоттинг с анти-HA, анти-Halo или другими антителами, обнаруживающими домашние белки (рис. 3). Вариант 3: Транскриптомный анализ. РНК-секвенирование и qRT-ПЦР (рис. 4)ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого анализа настоятельно рекомендуется использовать эмбрионы, отложенные с интервалом в 15 минут друг от друга. Разница в возрасте эмбрионов существенно влияет на результаты анализа.Анестезируют эмбрионы, инкубируя их при 4 ° C в течение 10 мин, через 2 ч после Z-REX. Выполните дехорионацию острыми щипцами (этап 6.1.3). (Необязательно) Выполните сегментацию щипцами (например, отделите голову от хвоста), если разные сегменты должны быть проанализированы отдельно. При извлечении РНК из целого эмбриона перенесите от трех до пяти эмбрионов в пробирку объемом 1,5 мл. При извлечении РНК из головы или хвоста перенесите 10-12 рассеченных сегментов в пробирку объемом 1,5 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проводить эксперимент с тремя-пятью биологическими репликами. Добавьте в пробирку 1 мл реагента TRIzol и стеклянные шарики.ПРИМЕЧАНИЕ: Было обнаружено, что стеклянные шарики работают лучше, чем шарики диоксида циркония для экстракции РНК. Перемешивайте смесь в течение 30 с.ПРИМЕЧАНИЕ: Если не приступить к следующему этапу немедленно, раствор можно хранить при -80 ° C в течение 1-3 недель. Извлеките РНК в соответствии с инструкциями производителя. Оцените качество и концентрацию РНК с помощью микрообъемного спектрофотометра и электрофореза в агарозном геле.ПРИМЕЧАНИЕ: РНК хорошего качества должна иметь соотношение A260/A280 около или выше 2,0. Либо отправьте РНК для секвенирования, либо обработайте 1 мкг РНК амплификационной ДНКазой I и выполните обратную транскрибировку с использованием верхней индексной обратной транскриптазы III и олиго-(dT)20. Выполните этот шаг в соответствии с инструкциями производителя. Проведите qRT-PCR и проанализируйте данные методом ΔΔCT9 (рис. 4B-D). Вариант 4: Анализ экспрессии POI и колокализации. Иммунофлюоресцентный анализ окрашивания цельного типа (рис. 5)ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы, фиксированные формальдегидом, хрупкие. Избегайте сильного встряхивания и обращайтесь с ним осторожно.Дехорионат эмбрионов, выполнив шаги 6.1.1-6.1.3. Перенесите эмбрионы в пробирку объемом 1,5 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: В каждой пробирке должно быть равное количество эмбрионов, и не более 40 эмбрионов. После того, как эмбрионы осядут на дно пробирки, удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) (pH 7,6). Повторите шаг 6.4.3 еще раз. Удалите надосадочную жидкость, добавьте 1 мл 4% формальдегида в PBS (pH 7,6) и инкубируйте пробирку при 4 ° C в течение ночи с легким покачиванием.ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы в растворе формальдегида можно хранить при температуре 4 °C в течение 1 недели. Удалите надосадочную жидкость, добавьте 1 мл метанола с температурой -20 °C и инкубируйте пробирку на боку при -20 °C в течение не менее 18 часов.ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить при температуре -20 °C в течение 1 месяца и более. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл буфера ФДТ (0,3% об./об. Triton X-100, 0,1% об./об. Tween-20 и 1% об./об. диметилсульфоксида [ДМСО] в буфер PBS). Повторите шаг 6.4.7 и инкубируйте пробирку при RT в течение 30 минут с легким покачиванием. Удалите надосадочную жидкость, добавьте 1 мл блокирующего буфера (10% инактивированной теплом эмбриональной бычьей сыворотки [FBS], 2% сывороточного альбумина крупного рогатого скота [BSA] и 0,1% v/v Tween-20 в буфере PBS) и инкубируйте пробирку при RT в течение 1 ч с легким покачиванием. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 200 мкл раствора первичного антитела (разбавленного в блокирующем буфере). Удалите надосадочную жидкость, добавьте 500 мкл раствора первичного антитела (разбавленного в блокирующем буфере) и инкубируйте пробирку при температуре 4 ° C в течение ночи с легким покачиванием.ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании нового первичного антитела стоит включить некоторые образцы без окрашивания первичных антител, чтобы они служили отрицательным контролем. Однако, в идеале, морфолинонокдаун или сконструированные эмбрионы с нокаутом генов, или эмбрионы, в которых экспрессия целевого белка была стимулирована, являются более надежными средствами для проверки антител. Удалите надосадочную жидкость, добавьте 1 мл буфера для ФДТ и инкубируйте пробирку при ЛТ в течение 30 минут с легким покачиванием. Повторите шаг 6.4.12. Удалите надосадочную жидкость, добавьте 1 мл блокирующего буфера и инкубируйте пробирку при RT в течение 1 ч с легким покачиванием.ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть защищены от света после этого этапа, чтобы предотвратить фотообесцвечивание флуорофора, конъюгированного с вторичным антителом. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 200 мкл вторичного раствора антител (разведенного в блокирующем буфере). Удалите надосадочную жидкость, добавьте 500 мкл раствора вторичных антител (разведенного в блокирующем буфере) и инкубируйте пробирку при RT в течение 1,5 ч с легким покачиванием. Удалите надосадочную жидкость, добавьте 1 мл буфера для ФДТ и инкубируйте пробирку при ЛТ в течение 30 минут с легким покачиванием. Повторите шаг 6.4.17. Установите эмбрионы на 2% агарозную пластину (изготовленную из PBS, pH 7,6) и сфотографируйте эмбрионы с помощью стереомикроскопа (яркое поле и соответствующие флуоресцентные каналы) (рис. 5A, B, D, F).ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании флуоресцентного стереомикроскопа Leica M165 FC используйте 25-кратное увеличение для получения изображений с хорошим разрешением. Количественная оценка / анализ интенсивности флуоресцентного сигнала с помощью ImageJ (NIH). Используйте инструмент « Выделение от руки » в ImageJ для количественной оценки сигнала в интересующей области.