Summary

Identificação e Isolamento de Progenitores Eritróides da Unidade Formadora de Explosão e da Unidade Formadora de Colônias de Tecido de Camundongo por Citometria de Fluxo

Published: November 04, 2022
doi:

Summary

Aqui, descrevemos um novo método citométrico de fluxo para isolamento prospectivo de progenitores eritróides de unidade formadora de explosão precoce (BFU-e) e eritróides de unidade formadora de colônias (UFC-e) diretamente da medula óssea e do baço frescos de camundongos. Este protocolo, desenvolvido com base em dados transcriptômicos de célula única, é o primeiro a isolar todos os progenitores eritróides do tecido com alta pureza.

Abstract

Os primeiros progenitores eritróides foram originalmente definidos por seu potencial de formação de colônias in vitro e classificados em “unidades” formadoras de explosões e formadoras de colônias conhecidas como BFU-e e UFC-e. Até recentemente, métodos para o isolamento prospectivo direto e completo de progenitores puros de BFU-e e CFU-e da medula óssea adulta recém-isolada não estavam disponíveis. Para resolver essa lacuna, um conjunto de dados de RNA-seq de célula única (scRNAseq) da medula óssea de camundongos foi analisado para a expressão de genes que codificam marcadores de superfície celular. Esta análise foi combinada com ensaios de destino celular, permitindo o desenvolvimento de uma nova abordagem citométrica de fluxo que identifica e permite o isolamento de subconjuntos completos e puros de progenitores BFU-e e CFU-e na medula óssea ou baço de camundongos. Esta abordagem também identifica outros subconjuntos progenitores, incluindo subconjuntos enriquecidos para basófilos/mastócitos e potenciais megacariocíticos. O método consiste em marcar células frescas da medula óssea ou do baço com anticorpos direcionados a Kit e CD55. Os progenitores que expressam ambos os marcadores são então subdivididos em cinco populações principais. A população 1 (P1 ou UFC-e, Kit+ CD55+ CD49f med/baixo CD105 med/alto CD71 med/alto) contém todos os progenitores da UFC-e e pode ser subdividida em P1-low (CD71med CD150 high) e P1-hi (CD71high CD150low), correspondendo a UFC-e precoce e tardia, respectivamente; A população 2 (P2 ou BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71low CD150high) contém todos os progenitores BFU-e; A população P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105 med/low CD150 low CD41low) é enriquecida para progenitores de basófilos/mastócitos; A população 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41+) é enriquecida para progenitores megacariocíticos; e a População 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105 med/low CD150high CD41) contém progenitores com eritróides, basófilos/mastócitos e potencial megacariocítico (EBMP) e progenitores multipotenciais (MPPs) eritróides/megacariocíticos/basófilos. Esta nova abordagem permite maior precisão na análise de progenitores eritróides e outros progenitores hematopoiéticos e também permite a referência à informação do transcriptoma para cada população de fluxo citometricamente definida.

Introduction

A eritropoiese pode ser dividida em duas fases principais: eritropoiese precoce e diferenciação terminal eritróide (Figura 1)1,2,3. Na eritropoiese precoce, as células-tronco hematopoiéticas se comprometem com a linhagem eritróide e dão origem a progenitores eritróides precoces, que foram identificados pela primeira vez na década de 1970 com base em seu potencial de formação de colônias em meio semissólido 4,5,6,7,8,9 . Em termos gerais, os progenitores eritróides são divididos em duas categorias: progenitores anteriores que dão origem a uma “explosão” (um grande agregado de aglomerados de células eritróides menores), denominada “unidade formadora de explosão eritróide” ou BFU-e 4,5,6; e sua progênie, que forma um único e pequeno aglomerado ou colônia de células eritróides, denominado “unidade formadora de colônias eritróide” ou UFC-e 7,8,9. BFU-e e UFC-e ainda não expressam genes eritróides terminais e não são morfologicamente reconhecíveis. Após uma série de divisões celulares de auto-renovação ou expansão, a UFC-e sofre uma troca transcricional na qual genes eritróides, como as globinas, são induzidos, fazendo a transição para a diferenciação terminal eritróide (ETD)1,10. Durante a ETD, os eritroblastos sofrem de três a cinco divisões celulares maturacionais antes de se enuclearem para formar reticulócitos, que amadurecem em glóbulos vermelhos.

Os eritroblastos durante a diferenciação terminal foram originalmente classificados com base em sua morfologia em proeritroblastos, basofílicos, policromáticos e ortocromáticos. O advento da citometria de fluxo permitiu sua classificação prospectiva e isolamento com base no tamanho celular (medido por espalhamento para frente, FSC) e dois marcadores de superfície celular, CD71 e Ter119 11,12,13 (Figura 1). Essa e outras abordagens citométricas de fluxo similares 14 revolucionaram a investigação dos aspectos moleculares e celulares da DTE, permitindo a análise específica do estágio de desenvolvimento de eritroblastos in vivo e in vitro 10,15,16,17,18,19,20. A abordagem CD71/Ter119 é agora utilizada rotineiramente na análise de precursores eritróides.

Até recentemente, uma abordagem citométrica de fluxo semelhante e acessível para o isolamento prospectivo direto e de alta pureza da UFC-e e da BFU-e do tecido do rato tem escapado aos investigadores. Em vez disso, os pesquisadores têm utilizado estratégias citométricas de fluxo que isolam apenas uma fração desses progenitores, muitas vezes na presença de células não eritróides que copurificam dentro dos mesmos subconjuntos citométricos de fluxo21. Consequentemente, a investigação de BFU-e e CFU-e limitou-se a sistemas de diferenciação in vitro que derivam e amplificam BFU-e e CFU-e de progenitores anteriores da medula óssea. É possível, então, aplicar estratégias citométricas de fluxo que distinguem a UFC-e da UFC-e nessas culturas enriquecidas com progenitores eritróides22,23. Uma abordagem alternativa faz uso da UFC-e fetal e da UPB-e, que são altamente enriquecidas na fração Ter119-negativa do fígado fetal do rato no meio da gestação 10,24,25. Nenhuma dessas abordagens, no entanto, permite a investigação de BFU-e e UFC-e adultas em seu estado fisiológico in vivo. A magnitude do desafio pode ser apreciada quando se lembra que, com base em ensaios de formação de colônias, essas células estão presentes na medula óssea adulta em uma frequência de apenas 0,025% e 0,3%, respectivamente6.

O protocolo aqui descrito é uma nova abordagem citométrica de fluxo baseada na análise transcriptômica de células da medula óssea de camundongos Kit+ recém-colhidas (o Kit é expresso por todas as populações progenitoras iniciais da medula óssea)1. Nossa abordagem contém alguns marcadores de superfície celular que já estavam em uso por Pronk et al.21,26. Transcriptomas unicelulares foram utilizados para determinar combinações de marcadores de superfície celular que identificam eritróides e outros progenitores hematopoiéticos precoces (Figura 2). Especificamente, a fração CD55+ de células Kit+ de linhagem negativa (Lin) pode ser subdividida em cinco populações, três das quais produzem segmentos contíguos da trajetória eritróide (Figura 2). As identidades transcriptômicas de cada uma dessas populações foram confirmadas por classificação, seguida de scRNAseq e projeção dos transcriptomas de célula única classificados de volta ao mapa transcriptômico original (a expressão gênica em cada uma das cinco populações e todo o conjunto de dados da medula óssea podem ser explorados em https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . O potencial de destino celular de cada uma das populações foi confirmado usando ensaios tradicionais de formação de colônias (Figura 2), bem como um novo ensaio de destino unicelular de alto rendimento 1,27. Essas análises mostram que a nova abordagem citométrica de fluxo resulta no isolamento de alta pureza de todos os progenitores de BFU-e e UFC-e da medula óssea adulta fresca e do baço. Especificamente, a população 1 (P1) contém apenas UFC-e e nenhum outro progenitor hematopoiético, e a população 2 (P2) contém todos os progenitores BFU-e da medula óssea e um pequeno número de UFC-e, mas nenhum outro progenitor1. O protocolo detalhado abaixo é ainda ilustrado com um experimento de exemplo em camundongos que foram injetados com solução salina ou com o hormônio eritropoiese-estimulante eritropoietina (Epo).

Protocol

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com os protocolos animais A-1586 e 202200017 aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Massachusetts Chan Medical School. NOTA: Dois protocolos são detalhados aqui: primeiro, análise citométrica de fluxo (seção 1), seguida por ajustes de protocolo para classificação de citometria de fluxo (seção 2). O protocolo abaixo usa um citômetro/classificador de fluxo com 10 canais. Um exemplo de configu…

Representative Results

O protocolo descreve uma abordagem citométrica de fluxo para identificar BFU-es e UFC-es em células recém-colhidas da medula óssea e do baço. Começa com a colheita de BM fresco e baço de ratos e imediatamente colocando o tecido no gelo. Todos os procedimentos são realizados a frio para preservar a viabilidade celular. As células são marcadas com um coquetel de anticorpos de “linhagem” que permite a exclusão de todas as células que expressam marcadores de linhagens sanguíneas diferenciadas (o coquetel FITC-Li…

Discussion

A capacidade de isolar prospectivamente progenitores BFU-e e CFU-e diretamente de tecido fresco com alta pureza já havia escapado aos pesquisadores. Nossa nova abordagem, validada usando scRNAseq e ensaios de destino celular 1,27, agora oferece as ferramentas para fazer isso.

Há uma série de pontos-chave para executar com sucesso os protocolos de classificação e analíticos. Primeiro, as células precisam ser giradas a 900 x g…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado pelos subsídios do NIH R01DK130498, R01DK120639 e R01HL141402

Materials

0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575020
1000 µL large orifice tips USA sceintific 1011-9000
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody BioLegend 131806
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody BioLegend 105826
Biotin-CD11b BD Biosciences 557395 M1/70 (clone)
Biotin-CD19 BD Biosciences 553784 1D3 (clone)
Biotin-CD4 BD Biosciences BDB553045 RM4-5 (clone)
Biotin-CD8a BD Biosciences BDB553029 53-6.7 (clone)
Biotin-F4/80 Biolegend 123106 BM8 (clone)
Biotin-Ly-6G and Ly-6C BD Biosciences 553125 RB6-8C5 (clone)
Biotin-TER-119 BD Biosciences 553672 TER-119 (clone)
Bovine Serum Albumin Sigma aldritch A1470
Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody BioLegend 313624
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody BioLegend 133921
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody BioLegend 115931
BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells BD Biosciences 563827
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch Laboratories 011-000-003
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Life Technologies D1306
Digital DIVA hardware and software for LSR II BD Biosciences
FITC anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend 123108
FITC Rat Anti-CD11b BD Biosciences 557396
FITC Rat Anti-Mouse CD19 BD Biosciences 553785
FITC Rat Anti-Mouse CD4 BD Biosciences 553047
FITC Rat Anti-Mouse CD8a BD Biosciences 553031
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C BD Biosciences 553127
FlowJo software  FlowJo version 10 Flow cytometer analysis software
LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer BD Biosciences Flow cytometer 
NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set Amazon
Normal rat serum Stem Cell Technologies 13551
PE anti-mouse CD105 Antibody BioLegend 120408
PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody BioLegend 113812
Phosphate Buffered Saline, 10x Solution Fisher scientific BP3994
Streptavidin Nanobeads BioLegend 480016 Magnetic beads

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Swaminathan, A., Hwang, Y., Winward, A., Socolovsky, M. Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (189), e64373, doi:10.3791/64373 (2022).

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