Summary

זיהוי ובידוד של יחידה יוצרת פרץ ויחידה יוצרת מושבה אבות אריתרואידים מרקמת עכבר על ידי ציטומטריה של זרימה

Published: November 04, 2022
doi:

Summary

כאן אנו מתארים שיטה ציטומטרית חדשנית לזרימה לבידוד פרוספקטיבי של אריתרואיד יחידה יוצרת התפרצות מוקדמת (BFU-e) ואריתרואיד יחידה יוצרת מושבה (CFU-e) ישירות ממח עצם וטחול טריים של עכבר. פרוטוקול זה, שפותח על סמך נתוני תעתיק חד-תאיים, הוא הראשון לבודד את כל אבות האריתרואידים של הרקמה בטוהר גבוה.

Abstract

אבות אריתרואידים מוקדמים הוגדרו במקור על ידי פוטנציאל יצירת המושבה שלהם במבחנה וסווגו ל”יחידות” יוצרות התפרצויות ויוצרות מושבות הידועות בשם BFU-e ו- CFU-e. עד לאחרונה, שיטות לבידוד פרוספקטיבי ישיר ומלא של אבות טהורים של BFU-e ו- CFU-e ממח עצם של עכבר בוגר שבודד זה עתה לא היו זמינות. כדי להתמודד עם פער זה, נותח מערך נתונים חד-תאי של RNA-seq (scRNAseq) של מח עצם עכבר לביטוי גנים המקודדים עבור סמני פני השטח של התא. ניתוח זה שולב עם מבחני גורל התא, ואיפשר פיתוח של גישה ציטומטרית חדשנית לזרימה המזהה ומאפשרת בידוד של תת-קבוצות שלמות וטהורות של אבות BFU-e ו-CFU-e במח עצם או טחול של עכבר. גישה זו מזהה גם תת-קבוצות אבות אחרות, כולל תת-קבוצות מועשרות עבור תאים בזופיליים/פיטום ופוטנציאלים מגה-קריוציטיים. השיטה כוללת תיוג של תאי מח עצם או טחול טריים עם נוגדנים המכוונים לקיט ו-CD55. אבות אבות המבטאים את שני הסמנים הללו מחולקים לאחר מכן לחמש אוכלוסיות עיקריות. אוכלוסייה 1 (P1 או CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high) מכילה את כל אבות ה-CFU-e ועשויה להיות מחולקת ל-P1-low (CD71 med CD150גבוה) ו-P1-hi (CD71גבוה CD150נמוך), המתאים ל-CFU-e מוקדם ומאוחר, בהתאמה; אוכלוסייה 2 (P2 או BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105med/high CD71נמוך CD150 גבוה) מכילה את כל אבות ה-BFU-e; אוכלוסייה P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/גבוה CD105 med/נמוך CD150נמוך CD41 נמוך) מועשרת עבור אבות אבזם של תאי בזופיל/פיטום; אוכלוסייה 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150גבוה CD41+) מועשרת עבור אבות מגה-קריוציטים; ואוכלוסיה 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150גבוה CD41) מכילה אבות עם אריתרואיד, תא בזופיל/פיטום, ופוטנציאל מגה-קריוציטי (EBMP) ואריתרואיד/מגה-קריוציטית/בזופילים רב-פוטנציאליים (MPPs). גישה חדשנית זו מאפשרת דיוק רב יותר בעת ניתוח אריתרואידים ואבות המטופויאטיים אחרים וגם מאפשרת התייחסות למידע תעתיק עבור כל אוכלוסייה מוגדרת ציטומטרית של זרימה.

Introduction

ניתן לחלק את אריתרופואזיס לשני שלבים עיקריים: אריתרופואזיס מוקדם והבחנה סופנית אריתרואידית (איור 1)1,2,3. באריתרופויאזיס מוקדם, תאי גזע המטופויאטיים מתחייבים לשושלת האריתרואידים ומולידים אבות אריתרואידים מוקדמים, שזוהו לראשונה בשנות השבעים בהתבסס על פוטנציאל יצירת המושבה שלהם בתווך מוצק למחצה 4,5,6,7,8,9 . באופן כללי, אבות אריתרואידים מחולקים לשתי קטגוריות: אבות קדמונים יותר שכל אחד מהם מוליד “פרץ” (צבר גדול של אשכולות תאים אריתרואידים קטנים יותר), הנקראים “אריתרואיד יחידה יוצר פרץ” או BFU-e 4,5,6; וצאצאיהם, שכל אחד מהם יוצר אשכול או מושבה בודדים וקטנים של תאי אריתרואיד, הנקראים “אריתרואיד יחידה יוצרת מושבה” או CFU-e 7,8,9. BFU-e ו-CFU-e עדיין לא מבטאים גנים אריתרואידים סופניים ואינם ניתנים לזיהוי מורפולוגית. לאחר מספר חלוקות תא של התחדשות עצמית או התפשטות, ה-CFU-e עובר מתג שעתוק שבו מושרים גנים אריתרואידיים כגון גלובין, ובכך עובר להתמיינות מסוף אריתרואידים (ETD)1,10. במהלך ETD, אריתרובלסטים עוברים שלוש עד חמש חלוקות תאי התבגרות לפני שהם מתאחדים ליצירת רטיקולוציטים, אשר מבשילים לתאים אדומים.

אריתרובלסטים במהלך התמיינות סופנית סווגו במקור על סמך המורפולוגיה שלהם לפרואריתרובלסטים, בזופיליים, פוליכרומטיים ואורתוכרומטיים. הופעתה של ציטומטריה של זרימה אפשרה את המיון והבידוד הפרוספקטיביים שלהם בהתבסס על גודל התא (שנמדד על ידי פיזור קדימה, FSC) ושני סמני פני השטח של התא, CD71 ו-Ter11911,12,13 (איור 1). זרימה זו וגישות ציטומטריות דומות14 חוללו מהפכה בחקר ההיבטים המולקולריים והתאיים של ETD, ומאפשרות ניתוח ספציפי לשלב התפתחותי של אריתרובלסטים in vivo ו– in vitro 10,15,16,17,18,19,20. גישת CD71/Ter119 משמשת כיום באופן שגרתי בניתוח של מבשרי אריתרואידים.

עד לאחרונה, גישה ציטומטרית דומה ונגישה לזרימה לבידוד פרוספקטיבי ישיר וטהור של CFU-e ו-BFU-e מרקמת עכבר חמקה מהחוקרים. במקום זאת, חוקרים השתמשו באסטרטגיות ציטומטריות זרימה המבודדות רק חלק קטן מאבות אבותיהם, לעתים קרובות בנוכחות תאים שאינם אריתרואידים המטהרים יחד בתוך אותן תת-קבוצות ציטומטריות של זרימה21. כתוצאה מכך, החקירה של BFU-e ו- CFU-e הוגבלה למערכות הבחנה חוץ גופית הגוזרות ומגבירות את BFU-e ו- CFU-e מאבות מח עצם קודמים. לאחר מכן ניתן ליישם אסטרטגיות ציטומטריות של זרימה המבדילות בין CFU-e ל-BFU-e בתרביות מועשרות באב אריתרואידי22,23. גישה חלופית עושה שימוש ב- CFU-e ו- BFU-e עובריים, המועשרים מאוד בחלק Ter119-שלילי של כבד העובר של העכבר באמצע ההיריון 10,24,25. עם זאת, אף אחת מהגישות הללו אינה מאפשרת לחקור BFU-e ו-CFU-e בוגרים במצבם הפיזיולוגי in vivo. ניתן להעריך את גודל האתגר כאשר נזכרים כי בהתבסס על מבחני היווצרות מושבה, תאים אלה נמצאים במח העצם הבוגר בתדירות של 0.025% ו-0.3% בלבד,בהתאמה 6.

הפרוטוקול המתואר כאן הוא גישה ציטומטרית חדשנית של זרימה המבוססת על אנליזה של תעתיק חד-תאי של תאי מח עצם של עכבר Kit+ שזה עתה נקטפו (הערכה מתבטאת על ידי כל אוכלוסיות האב הקדום של מח העצם)1. הגישה שלנו מכילה כמה סמני פני שטח של תאים שכבר היו בשימוש על ידי Pronk et al.21,26. תעתיקים חד-תאיים שימשו לקביעת שילובים של סמני פני השטח של התא שמזהים אריתרואידים ואבות המטופויאטיים מוקדמים אחרים (איור 2). באופן ספציפי, חלק CD55+ של תאי Kit+ שליליים לשושלת (Lin) עשוי להיות מחולק לחמש אוכלוסיות, ששלוש מהן מניבות מקטעים רציפים של מסלול האריתרואידים (איור 2). הזהויות השעתוק של כל אחת מאוכלוסיות אלה אושרו על ידי מיון, ולאחר מכן על ידי scRNAseq והשלכה של תעתיקים חד-תאיים ממוינים בחזרה למפת התעתיק המקורית (ניתן לחקור את ביטוי הגנים בכל אחת מחמש האוכלוסיות ואת כל מערך הנתונים של מח העצם ב-https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . פוטנציאל גורל התאים של כל אחת מהאוכלוסיות אושר באמצעות מבחני היווצרות מושבות מסורתיים (איור 2), כמו גם בדיקת גורל חד-תאית חדשהבתפוקה גבוהה 1,27. ניתוחים אלה מראים כי הגישה הציטומטרית החדשה של זרימה גורמת לבידוד בטוהר גבוה של כל אבות BFU-e ו- CFU-e של מח עצם וטחול בוגרים טריים. באופן ספציפי, אוכלוסייה 1 (P1) מכילה רק CFU-e ולא אבות המטופויאטיים אחרים, ואוכלוסיה 2 (P2) מכילה את כל אבות BFU-e של מח העצם ומספר קטן של CFU-e אך לא אבות אחרים1. הפרוטוקול המפורט שלהלן מודגם עוד יותר בניסוי לדוגמה בעכברים שהוזרק להם מי מלח או עם ההורמון המגרה אריתרופואזיס אריתרופואיטין (Epo).

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם לפרוטוקולים של בעלי חיים A-1586 ו-202200017 שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ’וסטס צ’אן. הערה: שני פרוטוקולים מפורטים כאן: ראשית, ניתוח ציטומטרי של זרימה (סעיף 1), ואחריו התאמות פרוטוקול למיון ציטומטרי ש…

Representative Results

הפרוטוקול מתאר גישה ציטומטרית של זרימה לזיהוי BFU-es ו-CFU-es בתאי מח עצם וטחול שזה עתה נקטפו. זה מתחיל בקצירת BM וטחול טריים מעכברים ומיד הנחת הרקמה על קרח. כל ההליכים מתבצעים בקור כדי לשמור על כדאיות התא. התאים מסומנים בקוקטייל נוגדנים “שושלת” המאפשר הרחקה של כל התאים המבטאים סמנים של שושלות דם מ…

Discussion

היכולת לבודד באופן פרוספקטיבי אבות BFU-e ו-CFU-e ישירות מרקמה טרייה בעלת טוהר גבוה חמקה בעבר מהחוקרים. הגישה החדשנית שלנו, שאומתה באמצעות scRNAseq ומבחני גורל התא 1,27, מציעה כעת את הכלים לעשות זאת.

ישנן מספר נקודות מפתח לביצוע מוצלח הן של המיון והן של ה?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענקי NIH R01DK130498, R01DK120639 ו- R01HL141402

Materials

0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575020
1000 µL large orifice tips USA sceintific 1011-9000
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody BioLegend 131806
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody BioLegend 105826
Biotin-CD11b BD Biosciences 557395 M1/70 (clone)
Biotin-CD19 BD Biosciences 553784 1D3 (clone)
Biotin-CD4 BD Biosciences BDB553045 RM4-5 (clone)
Biotin-CD8a BD Biosciences BDB553029 53-6.7 (clone)
Biotin-F4/80 Biolegend 123106 BM8 (clone)
Biotin-Ly-6G and Ly-6C BD Biosciences 553125 RB6-8C5 (clone)
Biotin-TER-119 BD Biosciences 553672 TER-119 (clone)
Bovine Serum Albumin Sigma aldritch A1470
Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody BioLegend 313624
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody BioLegend 133921
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody BioLegend 115931
BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells BD Biosciences 563827
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch Laboratories 011-000-003
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Life Technologies D1306
Digital DIVA hardware and software for LSR II BD Biosciences
FITC anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend 123108
FITC Rat Anti-CD11b BD Biosciences 557396
FITC Rat Anti-Mouse CD19 BD Biosciences 553785
FITC Rat Anti-Mouse CD4 BD Biosciences 553047
FITC Rat Anti-Mouse CD8a BD Biosciences 553031
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C BD Biosciences 553127
FlowJo software  FlowJo version 10 Flow cytometer analysis software
LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer BD Biosciences Flow cytometer 
NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set Amazon
Normal rat serum Stem Cell Technologies 13551
PE anti-mouse CD105 Antibody BioLegend 120408
PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody BioLegend 113812
Phosphate Buffered Saline, 10x Solution Fisher scientific BP3994
Streptavidin Nanobeads BioLegend 480016 Magnetic beads

References

  1. Tusi, B. K., et al. Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies. Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).
  2. Socolovsky, M. The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing. International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).
  3. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).
  4. Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S., Robinson, W. A. Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro. Hemopoiesis in Culture. , (1974).
  5. Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation. Blood. 47 (5), 777-792 (1976).
  6. Iscove, N. N., Sieber, F. Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture. Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).
  7. Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation. Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).
  8. Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron. Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).
  9. Gregory, C. J. Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture. Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).
  10. Pop, R., et al. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).
  11. Koulnis, M., et al. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).
  12. Liu, Y., et al. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood. 108 (1), 123-133 (2006).
  13. Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
  14. Chen, K., et al. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).
  15. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).
  16. Hidalgo, D., et al. EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis. Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).
  17. Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities. PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).
  18. Koulnis, M., et al. Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways. Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).
  19. Shearstone, J. R., et al. Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo. Science. 334 (6057), 799-802 (2011).
  20. Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response. PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).
  21. Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
  22. Dolznig, H., et al. Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors. Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).
  23. Li, J., et al. Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E. Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).
  24. Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
  25. Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal. Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).
  26. Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis. Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).
  27. Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro. Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).
  28. Erslev, A. J., Caro, J. Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia. Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).
  29. Koury, M. J., Bondurant, M. C. The molecular mechanism of erythropoietin action. European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).

Play Video

Cite This Article
Swaminathan, A., Hwang, Y., Winward, A., Socolovsky, M. Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (189), e64373, doi:10.3791/64373 (2022).

View Video