Presentert her er en detaljert immunhistokjemiprotokoll for å identifisere, validere og målrette funksjonelt relevante caspases i komplekse vev.
Familien av caspases er kjent for å formidle mange cellulære veier utover celledød, inkludert celledifferensiering, aksonal pathfinding og proliferasjon. Siden identifiseringen av familien av celledødsproteaser har det vært et søk etter verktøy for å identifisere og utvide funksjonen til bestemte familiemedlemmer i utviklings-, helse- og sykdomstilstander. Imidlertid er mange av de kommersielt tilgjengelige caspaseverktøyene som er mye brukt, ikke spesifikke for målrettet caspase. I denne rapporten avgrenser vi tilnærmingen vi har brukt for å identifisere, validere og målrette caspase-9 i nervesystemet ved hjelp av en ny inhibitor og genetiske tilnærminger med immunhistokjemiske avlesninger. Spesielt brukte vi retinal neuronal vev som en modell for å identifisere og validere tilstedeværelsen og funksjonen til caspases. Denne tilnærmingen muliggjør avhør av celletypespesifikke apoptotiske og ikke-apoptotiske caspase-9-funksjoner og kan brukes på andre komplekse vev og caspases av interesse. Å forstå funksjonene til caspases kan bidra til å utvide dagens kunnskap innen cellebiologi, og kan også være fordelaktig å identifisere potensielle terapeutiske mål på grunn av deres involvering i sykdom.
Caspasene er en familie av proteaser som regulerer utviklingscelledød, immunresponser og avvikende celledød ved sykdom 1,2. Selv om det er velkjent at medlemmer av caspase-familien er indusert i en rekke nevrodegenerative sykdommer, er detmer utfordrende å forstå hvilken caspase som driver sykdomspatologi. Slike studier krever verktøy for å identifisere, karakterisere og validere funksjonen til individuelle caspase familiemedlemmer. Parsing ut de relevante individuelle caspases er viktig både fra et mekanistisk og et terapeutisk synspunkt, da litteraturen har flere studier som gir bevis for de ulike rollene til caspases 4,5. Således, hvis målet er å målrette en caspase i en sykdom for en terapeutisk fordel, er det avgjørende å ha spesifikk målretting av det aktuelle familiemedlemmet (e). Tradisjonelle teknikker for å oppdage caspase nivåer i vev inkluderer western blotting og enzymatiske og fluorometriske tilnærminger 3,6. Imidlertid tillater ingen av disse tiltakene cellespesifikk påvisning av caspasenivåer, og i noen scenarier kan spaltede caspaser ofte ikke oppdages ved tradisjonelle proteinanalysetiltak. Det er kjent at caspases kan spille forskjellige apoptotiske og ikke-apoptotiske roller i samme vev7, derfor er det nødvendig med nøye karakterisering av cellespesifikke caspasenivåer for nøyaktig forståelse av utviklings- og sykdomsveier.
Denne studien viser caspase aktivering og funksjon i en modell av nevrovaskulær hypoksi-iskemi – retinal vene okklusjon (RVO)7,8. I et komplekst vev som netthinnen er det flere celletyper som kan påvirkes av hypoksi-iskemi indusert i RVO, inkludert gliaceller, nevroner og vaskulatur7. I den voksne musehinnen er det svært lite uttrykk for caspases som er tydelig i sunt vev, målt ved immunhistokjemi (IHC)7, men det er ikke tilfelle under utvikling9 eller i modeller av retinal sykdom10,11. IHC er en teknikk som er godt etablert i biomedisinsk forskning og har tillatt validering av sykdom og patologiske mål, identifisering av nye roller gjennom romlig lokalisering og kvantifisering av proteiner. I tilfeller der spaltede caspaseprodukter ikke kan detekteres ved western blot eller fluorometrisk analyse, eller den spesifikke celleplasseringen av distinkte caspases eller undersøkelse av caspase signalveier gjennom lokalisering, bør IHC brukes.
For å bestemme kaspasen(e) som er funksjonelt relevante i RVO, ble IHC brukt med validerte antistoffer for caspaser og cellulære markører. De tidligere studiene utført i laboratoriet viste at caspase-9 raskt ble aktivert i en modell av iskemisk slag og inhibering av caspase-9 med en svært spesifikk inhibitor beskyttet mot nevronal dysfunksjon og død12. Fordi netthinnen er en del av sentralnervesystemet (CNS), fungerer det som et modellsystem for å spørre og videre undersøke rollen som caspase-9 i nevrovaskulære skader13. Til dette formål ble musemodellen til RVO brukt til å studere den cellespesifikke plasseringen og fordelingen av caspase-9 og dens implikasjon i nevrovaskulær skade. RVO er en vanlig årsak til blindhet hos voksne i arbeidsfør alder som skyldes vaskulær skade14. Det ble funnet at caspase-9 ble uttrykt på en ikke-apoptotisk måte i endotelceller, men ikke i nevroner.
Som et vev har netthinnen fordelen av å bli visualisert som enten en flatmount, noe som gjør det mulig å forstå de vaskulære nettverkene, eller som tverrsnitt, som fremhever de neuronale retinale lagene. Kvantifisering av caspaseproteinuttrykk i tverrsnitt gir kontekst, med hensyn til hvilken caspase som er potensielt kritisk i retinal neuronal tilkobling og synsfunksjon ved å identifisere lokaliseringen av caspasen (e) i netthinnen. Etter identifisering og validering oppnås målretting av caspase av interesse ved bruk av induserbar cellespesifikk sletting av caspase identifisert. For potensielle terapeutiske undersøkelser ble relevansen av caspases av interesse testet ved hjelp av spesifikke verktøy for å hemme den aktiverte caspasen. For caspase-9 permeant en celle svært selektiv hemmer 7,15, Pen1-XBIR3 ble brukt. For denne rapporten ble 2 måneder gammel, mannlig C57BL / 6J-stamme og tamoxifen-induserbar endotelial caspase-9 knockout (iEC Casp9KO) stamme med C57BL / 6J bakgrunn brukt. Disse dyrene ble eksponert for musemodellen av RVO og C57BL/6J ble behandlet med den selektive kaspase-9-hemmeren Pen1-XBir3. Den beskrevne metodikken kan brukes på andre sykdomsmodeller i sentrale og perifere systemer 7,15.
Caspases er en flersidig familie av proteaser som best studeres for deres roller i celledød og betennelse; Imidlertid har nylig en rekke ikke-dødsfunksjoner blitt avdekket for noen familiemedlemmer 4,5. Mye av vår forståelse av caspase funksjon er avledet fra arbeid i cellekultur og fra inferensielle data fra menneskelig sykdom. Selv om det er verdsatt at det er avvikende induksjon, aktivering eller inaktivering av caspases i sykdom, har det vært utfordrende…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) stipend DGE – 1644869 og National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) fra National Institutes of Health (NIH), prisnummer F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (til CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (til AMP), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 til CMT), og Department of Defense Army / Air Force (DURIP til CMT).
anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
FIJI 2.3.0 | open source | ||
Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
Forcep | Roboz | RS-5015 | |
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
Perfusion pump | Masterflex | ||
Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
Prism 9.1 | GraphPad | ||
Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |