Kvantifisering av immunostained caspase-9 i retinal vev

Caspasene er en familie av proteaser som regulerer utviklingscelledød, immunresponser og avvikende celledød ved sykdom ^1,2. Selv om det er velkjent at medlemmer av caspase-familien er indusert i en rekke nevrodegenerative sykdommer, er det^{mer utfordrende å} forstå hvilken caspase som driver sykdomspatologi. Slike studier krever verktøy for å identifisere, karakterisere og validere funksjonen til individuelle caspase familiemedlemmer. Parsing ut de relevante individuelle caspases er viktig både fra et mekanistisk og et terapeutisk synspunkt, da litteraturen har flere studier som gir bevis for de ulike rollene til caspases ^4,5. Således, hvis målet er å målrette en caspase i en sykdom for en terapeutisk fordel, er det avgjørende å ha spesifikk målretting av det aktuelle familiemedlemmet (e). Tradisjonelle teknikker for å oppdage caspase nivåer i vev inkluderer western blotting og enzymatiske og fluorometriske tilnærminger ^3,6. Imidlertid tillater ingen av disse tiltakene cellespesifikk påvisning av caspasenivåer, og i noen scenarier kan spaltede caspaser ofte ikke oppdages ved tradisjonelle proteinanalysetiltak. Det er kjent at caspases kan spille forskjellige apoptotiske og ikke-apoptotiske roller i samme vev⁷, derfor er det nødvendig med nøye karakterisering av cellespesifikke caspasenivåer for nøyaktig forståelse av utviklings- og sykdomsveier.

Denne studien viser caspase aktivering og funksjon i en modell av nevrovaskulær hypoksi-iskemi – retinal vene okklusjon (RVO)^7,8. I et komplekst vev som netthinnen er det flere celletyper som kan påvirkes av hypoksi-iskemi indusert i RVO, inkludert gliaceller, nevroner og vaskulatur⁷. I den voksne musehinnen er det svært lite uttrykk for caspases som er tydelig i sunt vev, målt ved immunhistokjemi (IHC)⁷, men det er ikke tilfelle under utvikling⁹ eller i modeller av retinal sykdom^10,11. IHC er en teknikk som er godt etablert i biomedisinsk forskning og har tillatt validering av sykdom og patologiske mål, identifisering av nye roller gjennom romlig lokalisering og kvantifisering av proteiner. I tilfeller der spaltede caspaseprodukter ikke kan detekteres ved western blot eller fluorometrisk analyse, eller den spesifikke celleplasseringen av distinkte caspases eller undersøkelse av caspase signalveier gjennom lokalisering, bør IHC brukes.

For å bestemme kaspasen(e) som er funksjonelt relevante i RVO, ble IHC brukt med validerte antistoffer for caspaser og cellulære markører. De tidligere studiene utført i laboratoriet viste at caspase-9 raskt ble aktivert i en modell av iskemisk slag og inhibering av caspase-9 med en svært spesifikk inhibitor beskyttet mot nevronal dysfunksjon og død¹². Fordi netthinnen er en del av sentralnervesystemet (CNS), fungerer det som et modellsystem for å spørre og videre undersøke rollen som caspase-9 i nevrovaskulære skader¹³. Til dette formål ble musemodellen til RVO brukt til å studere den cellespesifikke plasseringen og fordelingen av caspase-9 og dens implikasjon i nevrovaskulær skade. RVO er en vanlig årsak til blindhet hos voksne i arbeidsfør alder som skyldes vaskulær skade¹⁴. Det ble funnet at caspase-9 ble uttrykt på en ikke-apoptotisk måte i endotelceller, men ikke i nevroner.

Som et vev har netthinnen fordelen av å bli visualisert som enten en flatmount, noe som gjør det mulig å forstå de vaskulære nettverkene, eller som tverrsnitt, som fremhever de neuronale retinale lagene. Kvantifisering av caspaseproteinuttrykk i tverrsnitt gir kontekst, med hensyn til hvilken caspase som er potensielt kritisk i retinal neuronal tilkobling og synsfunksjon ved å identifisere lokaliseringen av caspasen (e) i netthinnen. Etter identifisering og validering oppnås målretting av caspase av interesse ved bruk av induserbar cellespesifikk sletting av caspase identifisert. For potensielle terapeutiske undersøkelser ble relevansen av caspases av interesse testet ved hjelp av spesifikke verktøy for å hemme den aktiverte caspasen. For caspase-9 permeant en celle svært selektiv hemmer ^7,15, Pen1-XBIR3 ble brukt. For denne rapporten ble 2 måneder gammel, mannlig C57BL / 6J-stamme og tamoxifen-induserbar endotelial caspase-9 knockout (iEC Casp9KO) stamme med C57BL / 6J bakgrunn brukt. Disse dyrene ble eksponert for musemodellen av RVO og C57BL/6J ble behandlet med den selektive kaspase-9-hemmeren Pen1-XBir3. Den beskrevne metodikken kan brukes på andre sykdomsmodeller i sentrale og perifere systemer ^7,15.