القياس الكمي لكاسباز-9 المناعي في أنسجة الشبكية
Summary
يظهر هنا بروتوكول مفصل للكيمياء الهيستولوجية المناعية لتحديد الكاسباسات ذات الصلة وظيفيا في الأنسجة المعقدة والتحقق من صحتها واستهدافها.
Abstract
من المعروف أن عائلة الكاسباز تتوسط في العديد من المسارات الخلوية بعد موت الخلايا ، بما في ذلك تمايز الخلايا ، وإيجاد المسار المحوري ، والتكاثر. منذ تحديد عائلة بروتياز موت الخلايا ، كان هناك بحث عن أدوات لتحديد وتوسيع وظيفة أفراد الأسرة المحددين في حالات التنمية والصحة والمرض. ومع ذلك ، فإن العديد من أدوات caspase المتاحة تجاريا حاليا والمستخدمة على نطاق واسع ليست خاصة بالكاسباز المستهدف. في هذا التقرير ، نحدد النهج الذي استخدمناه لتحديد caspase-9 والتحقق من صحته واستهدافه في الجهاز العصبي باستخدام مثبط جديد ونهج وراثي مع قراءات كيميائية مناعية. على وجه التحديد ، استخدمنا الأنسجة العصبية في شبكية العين كنموذج لتحديد والتحقق من وجود ووظيفة الكاسباز. يتيح هذا النهج استجواب وظائف كاسباز-9 الخاصة بالخلايا المبرمج وغير المبرمج ويمكن تطبيقها على الأنسجة المعقدة الأخرى والكاسباز ذات الأهمية. يمكن أن يساعد فهم وظائف الكاسباز في توسيع المعرفة الحالية في بيولوجيا الخلية ، ويمكن أن يكون مفيدا أيضا لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة بسبب تورطها في المرض.
Introduction
الكاسباز هي عائلة من البروتياز التي تنظم موت الخلايا النمائي ، والاستجابات المناعية ، وموت الخلايا الشاذة في المرض 1,2. في حين أنه من المعروف جيدا أن أفراد عائلة caspase يتم تحريضهم في مجموعة متنوعة من الأمراض التنكسية العصبية ، فإن فهم أي caspase يقود أمراض المرض هو أكثر صعوبة3. تتطلب مثل هذه الدراسات أدوات لتحديد وتوصيف والتحقق من صحة وظيفة أفراد عائلة الكاسباز الفردية. يعد تحليل الكاسباس الفردي ذي الصلة أمرا مهما من وجهة نظر ميكانيكية وعلاجية ، حيث تحتوي الأدبيات على دراسات متعددة تقدم أدلة على الأدوار المتنوعة للكاسباس 4,5. وبالتالي ، إذا كان الهدف هو استهداف كاسباز في مرض ما للحصول على فائدة علاجية ، فمن الأهمية بمكان أن يكون هناك استهداف محدد لفرد (أفراد) الأسرة المعنيين. تشمل التقنيات التقليدية للكشف عن مستويات الكاسباز في الأنسجة النشاف الغربي والنهج الأنزيمي والفلورومتري 3,6. ومع ذلك ، لا يسمح أي من هذه التدابير بالكشف عن مستويات الكاسباز الخاصة بالخلية ، وفي بعض السيناريوهات ، لا يمكن اكتشاف الكاسباز المشقوق في كثير من الأحيان من خلال تدابير تحليل البروتين التقليدية. من المعروف أن الكاسباز يمكن أن يلعب أدوارا مختلفة في موت الخلايا المبرمج وغير موت الخلايا المبرمج في نفس النسيج7 ، لذلك هناك حاجة إلى توصيف دقيق لمستويات الكاسباز الخاصة بالخلية من أجل فهم دقيق لمسارات النمو والمرض.
تظهر هذه الدراسة تنشيط الكاسباز ووظيفته في نموذج نقص الأكسجة الوعائية العصبية – نقص التروية – انسداد الوريد الشبكي (RVO)7,8. في الأنسجة المعقدة مثل شبكية العين ، هناك أنواع متعددة من الخلايا التي يمكن أن تتأثر بنقص الاكسكار الناجم عن نقص التروية الناجم عن RVO ، بما في ذلك الخلايا الدبقية والخلايا العصبية والأوعية الدموية7. في شبكية العين الفأر البالغ ، هناك القليل جدا من التعبير عن الكاسباس الواضح في الأنسجة السليمة ، كما تم قياسه بواسطة الكيمياء المناعية (IHC)7 ، ولكن هذا ليس هو الحال أثناء التطور9 أو في نماذج أمراض الشبكية10,11. IHC هي تقنية راسخة في البحوث الطبية الحيوية وسمحت بالتحقق من صحة الأمراض والأهداف المرضية ، وتحديد الأدوار الجديدة من خلال التوطين المكاني ، والقياس الكمي للبروتينات. في الحالات التي لا يمكن فيها اكتشاف منتجات الكاسباز المشقوقة عن طريق اللطخة الغربية أو التحليل الفلورومتري ، ولا موقع الخلية المحدد للكاسباس المتميز أو استجواب مسارات إشارات الكاسباز من خلال التوطين ، يجب استخدام IHC.
من أجل تحديد caspase (ق) ذات الصلة وظيفيا في RVO ، تم استخدام IHC مع الأجسام المضادة التي تم التحقق من صحتها للكاسباز والعلامات الخلوية. أظهرت الدراسات السابقة التي أجريت في المختبر أن caspase-9 تم تنشيطه بسرعة في نموذج للسكتة الدماغية الإقفارية وتثبيط caspase-9 مع مثبط محدد للغاية محمي من الخلل العصبي والموت12. نظرا لأن شبكية العين جزء من الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، فهي بمثابة نظام نموذجي للاستعلام والتحقيق في دور caspase-9 في إصابات الأوعية الدموية العصبية13. تحقيقا لهذه الغاية ، تم استخدام نموذج الماوس من RVO لدراسة الموقع الخاص بالخلية وتوزيع caspase-9 وتأثيره في إصابة الأوعية الدموية العصبية. RVO هو سبب شائع للعمى لدى البالغين في سن العمل ينتج عن إصابة الأوعية الدموية14. وقد وجد أن caspase-9 تم التعبير عنه بطريقة غير موت الخلايا المبرمج في الخلايا البطانية ، ولكن ليس في الخلايا العصبية.
كنسيج ، تتمتع شبكية العين بميزة تصورها إما على أنها مسطحة ، مما يسمح بتقدير شبكات الأوعية الدموية ، أو كمقاطع عرضية ، مما يسلط الضوء على طبقات الشبكية العصبية. يوفر القياس الكمي لتعبير بروتين الكاسباز في المقاطع العرضية السياق ، فيما يتعلق بالكاسباز الذي يحتمل أن يكون حاسما في الاتصال العصبي للشبكية ووظيفة الرؤية من خلال تحديد توطين الكاسباز (الكاسباز) في شبكية العين. بعد التحديد والتحقق من الصحة ، يتم تحقيق استهداف caspase محل الاهتمام باستخدام حذف محدد للخلية المستحثة من caspase المحدد. بالنسبة للاستفسارات العلاجية المحتملة ، تم اختبار أهمية الكاسباز محل الاهتمام باستخدام أدوات محددة لتثبيط الكاسباز المنشط. بالنسبة ل caspase-9 ، كانت الخلية مثبطا انتقائيا للغاية 7,15 ، تم استخدام Pen1-XBIR3. بالنسبة لهذا التقرير ، تم استخدام سلالة C57BL / 6J البالغة من العمر شهرين وسلالة كاسباز 9 البطانية المستحثة بعقار تاموكسيفين (iEC Casp9KO) مع خلفية C57BL / 6J. تعرضت هذه الحيوانات لنموذج الفأر RVO وعولجت C57BL / 6J بمثبط كاسباز -9 الانتقائي ، Pen1-XBir3. يمكن تطبيق المنهجية الموصوفة على نماذج أخرى من المرض في الأنظمة المركزية والطرفية 7,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Caspases هي عائلة متعددة الأعضاء من البروتياز أفضل دراسة لدورها في موت الخلايا والالتهابات. ومع ذلك ، في الآونة الأخيرة تم الكشف عن مجموعة متنوعة من وظائف عدم الوفاة لبعض أفراد الأسرة 4,5. يستمد الكثير من فهمنا لوظيفة الكاسباز من العمل في زراعة الخلايا ومن البيا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة برنامج زمالة أبحاث الخريجين التابع لمؤسسة العلوم الوطنية (NSF-GRFP) DGE – 1644869 والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) ، رقم الجائزة F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (إلى CKCO) ، المعهد الوطني للعيون (NEI) 5T32EY013933 (إلى AMP) ، المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (RO1 NS081333 ، R03 NS099920 إلى CMT) ، ووزارة الدفاع الجيش / القوات الجوية (DURIP إلى CMT).
Materials
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
- Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).
- Troy, C. M., Jean, Y. Y. Caspases: therapeutic targets in neurologic disease. Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).
- Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease. Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147 (4), 742-758 (2011).
- Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).
- Tisch, N., et al. Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development. The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).
- Chi, W., et al. HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma. Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).
- Thomas, C. N., et al. Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).
- Kuida, K., et al. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell. 94 (3), 325-337 (1998).
- Troy, C. M., et al. Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation. Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).
