망막 조직에서 면역염색 카스파제-9의 정량화
Summary
여기에 제시된 것은 복잡한 조직에서 기능적으로 관련된 카스파제를 식별, 검증 및 표적으로 삼기 위한 상세한 면역조직화학 프로토콜입니다.
Abstract
카스파제 계열은 세포 분화, 축삭 경로 찾기 및 증식을 포함하여 세포 사멸을 넘어 많은 세포 경로를 매개하는 것으로 알려져 있습니다. 세포 사멸 프로테아제 패밀리의 동정 이후, 발달, 건강 및 질병 상태에서 특정 가족 구성원의 기능을 식별하고 확장하는 도구에 대한 검색이 있었습니다. 그러나, 널리 사용되는 현재 상업적으로 이용가능한 카스파제 툴 중 다수는 표적화된 카스파제에 특이적이지 않다. 이 보고서에서 우리는 새로운 억제제를 사용하여 신경계에서 caspase-9를 식별, 검증 및 표적으로 삼는 데 사용한 접근 방식과 면역 조직 화학적 판독을 통한 유전 적 접근 방식을 설명합니다. 특히, 우리는 망막 신경 조직을 모델로 사용하여 카스파제의 존재와 기능을 확인하고 검증했습니다. 이 접근법은 세포 유형 특이적 세포사멸 및 비-아폽토시스 카스파제-9 기능의 질의를 가능하게 하고, 관심있는 다른 복잡한 조직 및 카스파제에 적용될 수 있다. 카스파제의 기능을 이해하면 세포 생물학에 대한 현재 지식을 확장하는 데 도움이 될 수 있으며 질병에 관여하기 때문에 잠재적인 치료 표적을 식별하는 데에도 유리할 수 있습니다.
Introduction
카스파제는 질병1,2에서 발달 세포 사멸, 면역 반응 및 비정상적인 세포 사멸을 조절하는 프로테아제 계열입니다. 카스파제 계열의 구성원이 다양한 신경퇴행성 질환에서 유도된다는 것은 잘 알려져 있지만, 어떤 카스파아제가 질병 병리를 유발하는지 이해하는 것은 더 어렵습니다3. 이러한 연구에는 개별 카스파제 가족 구성원의 기능을 식별, 특성화 및 검증하는 도구가 필요합니다. 관련 개별 카스파제를 파싱하는 것은 기계론적 관점과 치료적 관점 모두에서 중요한데, 이는 문헌에 카스파제 4,5의 다양한 역할에 대한 증거를 제공하는 여러 연구가 있기 때문입니다. 따라서, 목표가 치료 이익을 위해 질병에서 카스파아제를 표적화하는 것이라면, 관련 가족 구성원(들)의 특정 표적화를 갖는 것이 중요하다. 조직에서 카스파아제 수준을 검출하는 전통적인 기술에는 웨스턴 블로팅과 효소 및 형광 측정 접근법 3,6이 포함됩니다. 그러나 이러한 측정 중 어느 것도 카스파아제 수준의 세포 특이적 검출을 허용하지 않으며 일부 시나리오에서는 절단된 카스파아제를 기존 단백질 분석 측정으로 검출할 수 없는 경우가 많습니다. 카스파제는 동일한 조직에서 상이한 세포사멸 및 비-아폽토시스 역할을 할 수 있는 것으로 알려져 있다.7, 따라서 발달 및 질병 경로의 정확한 이해를 위해서는 세포-특이적 카스파아제 수준의 신중한 특성화가 필요하다.
이 연구는 신경 혈관 저산소증-허혈-망막 정맥 폐색 (RVO) 모델에서 카스파 아제 활성화 및 기능을 보여줍니다7,8. 망막과 같은 복잡한 조직에는 신경교 세포, 뉴런 및 혈관 구조7을 포함하여 RVO에서 유도 된 저산소증 허혈에 의해 영향을받을 수있는 여러 세포 유형이 있습니다. 성인 마우스 망막에서는 면역조직화학(IHC)7으로 측정한 건강한 조직에서 명백한 카스파제의 발현이 거의 없지만, 발달9 또는 망막 질환 모델10,11에서는 그렇지 않습니다. IHC는 생물 의학 연구에서 잘 확립 된 기술이며 질병 및 병리학 적 표적의 검증, 공간 국소화를 통한 새로운 역할 식별 및 단백질 정량화를 가능하게했습니다. 절단된 카스파아제 생성물이 웨스턴 블롯 또는 형광 분석으로 검출될 수 없는 경우, 또는 별개의 카스파제의 특정 세포 위치 또는 국소화를 통한 카스파아제 신호 전달 경로의 조사가 불가능한 경우, IHC를 사용해야 한다.
RVO에서 기능적으로 관련된 카스파제를 결정하기 위해, IHC를 카스파제 및 세포 마커에 대한 검증된 항체와 함께 사용하였다. 실험실에서 수행 된 이전 연구에 따르면 caspase-9는 허혈성 뇌졸중 모델에서 빠르게 활성화되고 신경 기능 장애 및 사망12로부터 보호되는 고도로 특이적인 억제제로 caspase-9를 억제했습니다. 망막은 중추 신경계 (CNS)의 일부이기 때문에 신경 혈관 손상에서 카스파 제 -9의 역할을 쿼리하고 추가로 조사하는 모델 시스템 역할을합니다13. 이를 위해 RVO의 마우스 모델을 사용하여 caspase-9의 세포 특이적 위치와 분포 및 신경혈관 손상에 미치는 영향을 연구했습니다. RVO는 혈관 손상으로 인한 근로 연령 성인의 실명의 일반적인 원인입니다14. caspase-9는 내피 세포에서 비 세포 사멸 방식으로 발현되었지만 뉴런에서는 발현되지 않는 것으로 밝혀졌습니다.
조직으로서 망막은 혈관 네트워크를 이해할 수있는 플랫 마운트 또는 신경 망막 층을 강조하는 단면으로 시각화되는 장점이 있습니다. 단면에서 카스파아제 단백질 발현의 정량화는 망막에서 카스파아제의 국소화를 식별함으로써 망막 뉴런 연결성 및 시력 기능에 잠재적으로 중요한 카스파아제에 관한 맥락을 제공합니다. 확인 및 검증 후, 관심있는 카스파아제의 표적화는 확인된 카스파아제의 유도성 세포 특이적 결실을 사용하여 달성된다. 잠재적인 치료 문의를 위해, 관심 있는 카스파제의 관련성은 활성화된 카스파제를 억제하기 위해 특정 도구를 사용하여 테스트되었습니다. 카스파제-9의 경우 세포 투과성 고도로 선택적인 억제제 7,15, Pen1-XBIR3이 사용되었다. 이 보고서에서는 C57BL/6J 배경을 가진 2개월 된 수컷 C57BL/6J 균주와 타목시펜 유도성 내피 카스파제-9 녹아웃(iEC Casp9KO) 균주가 사용되었습니다. 이들 동물을 RVO 및 C57BL/6J의 마우스 모델에 노출시키고 카스파제-9 선택적 억제제인 Pen1-XBir3으로 처리하였다. 설명된 방법론은 중앙 및 주변 시스템(7, 15)에서 질병의 다른 모델에 적용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Caspases는 세포 사멸 및 염증에서의 역할에 대해 가장 잘 연구 된 프로테아제의 다중 구성원 계열입니다. 그러나 최근에는 일부 가족 구성원에 대해 다양한 비 사망 기능이 발견되었습니다 4,5. 카스파아제 기능에 대한 우리의 이해의 대부분은 세포 배양에서의 작업과 인간 질병의 추론 데이터에서 파생됩니다. 질병에서 카스파제의 비정상적인 유도, 활?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램(NSF-GRFP) 보조금 DGE – 1644869 및 국립 보건원(NIH)의 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(NINDS), 수상 번호 F99NS124180 NIH NINDS 다양성 전문 F99(CKCO), 국립 안과 연구소(NEI) 5T32EY013933(AMP), 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(RO1 NS081333, R03 NS099920에서 CMT), 국방부 육군/공군(DURIP에서 CMT로).
Materials
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
- Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).
- Troy, C. M., Jean, Y. Y. Caspases: therapeutic targets in neurologic disease. Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).
- Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease. Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147 (4), 742-758 (2011).
- Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).
- Tisch, N., et al. Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development. The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).
- Chi, W., et al. HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma. Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).
- Thomas, C. N., et al. Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).
- Kuida, K., et al. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell. 94 (3), 325-337 (1998).
- Troy, C. M., et al. Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation. Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).
