视网膜组织中免疫染色半胱天冬酶-9的定量

半胱天冬酶是调节疾病^1，2中发育细胞死亡，免疫反应和异常细胞死亡的蛋白酶家族。虽然众所周知，半胱天冬酶家族的成员在各种神经退行性疾病中被诱导，但了解哪种半胱天冬酶驱动疾病病理学^{更具挑战性}3。此类研究需要工具来识别、表征和验证单个半胱天冬酶家族成员的功能。从机制和治疗的角度来看，解析相关的个体半胱天冬酶都很重要，因为文献中有多项研究提供了半胱天冬酶不同作用的证据4^，5。因此，如果目标是针对疾病中的半胱天冬酶以获得治疗益处，那么针对相关家庭成员的特定目标至关重要。检测组织中半胱天冬酶水平的传统技术包括蛋白质印迹和酶法和荧光法^3，6。然而，这些措施都不允许对半胱天冬酶水平进行细胞特异性检测，在某些情况下，裂解的半胱天冬酶通常无法通过传统的蛋白质分析措施检测到。众所周知，半胱天冬酶可以在同一组织中发挥不同的凋亡和非凋亡作用⁷，因此需要仔细表征细胞特异性半胱天冬酶水平，以准确了解发育和疾病途径。

这项研究显示了半胱天冬酶在神经血管缺氧缺血 – 视网膜静脉阻塞（RVO）模型中的激活和功能^7，8。在视网膜等复杂组织中，有多种细胞类型可能受到 RVO 诱导的缺氧缺血的影响，包括神经胶质细胞、神经元和脉管系统⁷。在成年小鼠视网膜中，通过免疫组织化学（IHC^）7测量，健康组织中半胱天冬酶的表达很少，但在发育^过程中 情况并非如此9或视网膜疾病^{模型10，11}。IHC是一种在生物医学研究中成熟的技术，可以验证疾病和病理靶点，通过空间定位和蛋白质量化来识别新角色。如果蛋白质印迹或荧光分析无法检测到裂解的半胱天冬酶产物，也无法通过定位检测不同半胱天冬酶的特定细胞位置或询问半胱天冬酶信号通路，则应使用IHC。

为了确定RVO中功能相关的半胱天冬酶，将IHC与经过验证的半胱天冬酶抗体和细胞标志物一起使用。先前在实验室进行的研究表明，半胱天冬酶-9在缺血性中风和半胱天冬酶-9的抑制模型中被迅速激活，具有高度特异性的抑制剂，可防止神经元功能障碍和死亡¹²。由于视网膜是中枢神经系统（CNS）的一部分，因此它可作为模型系统来查询和进一步研究半胱天冬酶-9在神经血管损伤中的作用¹³。为此，利用RVO小鼠模型研究半胱天冬酶-9的细胞特异性位置和分布及其在神经血管损伤中的意义。RVO是由血管损伤引起的工作年龄成年人失明的常见原因¹⁴。发现半胱天冬酶-9在内皮细胞中以非凋亡方式表达，但不在神经元中表达。

作为一种组织，视网膜的优点是可以可视化为平面安装，允许欣赏血管网络，或作为横截面，突出神经元视网膜层。横截面中半胱天冬酶蛋白表达的定量提供了背景，通过识别半胱天冬酶在视网膜中的定位，半胱天冬酶在视网膜神经元连接和视觉功能中具有潜在关键意义。在鉴定和验证之后，使用鉴定的半胱天冬酶的诱导细胞特异性缺失来实现目标半胱天冬酶的靶向。对于潜在的治疗查询，使用特定工具来抑制活化的半胱天冬酶来测试感兴趣的半胱天冬酶的相关性。对于半胱天冬酶-9，细胞通透性高选择性抑制剂⁷，^15，使用Pen1-XBIR3。对于本报告，使用了具有C57BL / 6J背景的2个月大的男性C57BL / 6J菌株和他莫昔芬诱导的内皮半胱天冬酶-9敲除（iEC Casp9KO）菌株。这些动物暴露于RVO小鼠模型，C57BL / 6J用半胱天冬酶-9选择性抑制剂Pen1-XBir3处理。所描述的方法可以应用于中枢和外周系统中的其它疾病模型^7，15。