Summary

Trennung von Immunzellsubpopulationen in peripheren Blutproben von Kindern mit infektiöser Mononukleose

Published: September 07, 2022
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Summary

Wir beschreiben eine Methode, die immunmagnetische Beads und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung kombiniert, um definierte Immunzellsubpopulationen peripherer mononukleärer Blutzellen (Monozyten, CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, B-Zellen und natürliche Killerzellen) zu isolieren und zu analysieren. Mit dieser Methode können magnetisch und fluoreszierend markierte Zellen gereinigt und analysiert werden.

Abstract

Die infektiöse Mononukleose (IM) ist ein akutes Syndrom, das meist mit einer primären Infektion mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) einhergeht. Die wichtigsten klinischen Symptome sind unregelmäßiges Fieber, Lymphadenopathie und signifikant erhöhte Lymphozyten im peripheren Blut. Der pathogene Mechanismus von IM ist noch unklar; Es gibt keine wirksame Behandlungsmethode dafür, da hauptsächlich symptomatische Therapien zur Verfügung stehen. Die Hauptfrage in der EBV-Immunbiologie ist, warum nur eine kleine Untergruppe infizierter Personen schwere klinische Symptome zeigt und sogar EBV-assoziierte Malignome entwickelt, während die meisten Personen für das Leben mit dem Virus asymptomatisch sind.

B-Zellen sind zuerst an IM beteiligt, da EBV-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche präsentiert werden. Natürliche Killerzellen (NK) sind zytotoxische angeborene Lymphozyten, die für die Abtötung von EBV-infizierten Zellen wichtig sind. Der Anteil der CD4+ T-Zellen nimmt ab, während der Anteil der CD8+ T-Zellen während einer akuten EBV-Infektion dramatisch zunimmt, und die Persistenz von CD8+ T-Zellen ist wichtig für die lebenslange Kontrolle von IM. Diese Immunzellen spielen eine wichtige Rolle bei IM, und ihre Funktionen müssen separat identifiziert werden. Zu diesem Zweck werden Monozyten zuerst von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von IM-Individuen mit CD14-Mikroperlen, einer Säule und einem Magnetabscheider getrennt.

Die restlichen PBMCs werden mit Peridinin-Chlorophyll-Protein (PerCP)/Cyanin 5.5 Anti-CD3, Allophycocyanin (APC)/Cyanin 7 Anti-CD4, Phycoerythrin (PE) Anti-CD8, Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Anti-CD19, APC Anti-CD56 und APC Anti-CD16 Antikörpern gefärbt, um CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen mit einem Durchflusszytometer zu sortieren. Darüber hinaus wurde eine Transkriptomsequenzierung von fünf Subpopulationen durchgeführt, um deren Funktionen und pathogene Mechanismen in IM zu untersuchen.

Introduction

Das Epstein-Barr-Virus (EBV), ein γ-Herpesvirus, das auch als humanes Herpesvirus Typ 4 bekannt ist, ist in der menschlichen Bevölkerung allgegenwärtig und etabliert eine lebenslange latente Infektion bei mehr als 90% der erwachsenen Bevölkerung1. Die meisten EBV-Primärinfektionen treten im Kindes- und Jugendalter auf, wobei sich ein Teil der Patienten mit infektiöser Mononukleose (IM)2 manifestiert und eine charakteristische Immunpathologie aufweist, einschließlich einer aktivierten Immunantwort mit CD8+ T-Zellen im Blut und einer vorübergehenden Proliferation von EBV-infizierten B-Zellen im Oropharynx3. Der Verlauf der IM kann 2-6 Wochen dauern und die Mehrheit der Patienten erholt sich gut4. Einige Personen entwickeln jedoch persistierende oder wiederkehrende IM-ähnliche Symptome mit hoher Morbidität und Mortalität, die als chronisch aktive EBV-Infektion (CAEBV) eingestuft wird5. Darüber hinaus ist EBV ein wichtiges onkogenes Virus, das eng mit einer Vielzahl von Malignomen verwandt ist, darunter epithelioide und lymphatische Malignome wie Nasopharynxkarzinom, Burkitt-Lymphom, Hodgkin-Lymphom (HL) und T/NK-Zell-Lymphom6. Obwohl EBV seit über 50 Jahren untersucht wird, sind seine Pathogenese und der Mechanismus, durch den es die Proliferation von Lymphozyten induziert, nicht vollständig aufgeklärt.

Mehrere Studien haben die molekularen Signaturen für die Immunpathologie der EBV-Infektion durch Transkriptomsequenzierung untersucht. Zhong et al. analysierten das Whole-Transkriptom-Profiling von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von chinesischen Kindern mit IM oder CAEBV, um festzustellen, dass CD8+ T-Zellexpansion überwiegend in der IM-Gruppe7 gefunden wurde, was darauf hindeutet, dass CD8+ T-Zellen eine wichtige Rolle bei IM spielen könnten. In ähnlicher Weise fand eine andere Studie niedrigere Anteile an EBV-spezifischen zytotoxischen T- und CD19+ B-Zellen und höhere Prozentsätze von CD8+ T-Zellen bei Patienten mit IM, die durch eine primäre EBV-Infektion verursacht wurden, als bei Patienten mit IM, die sowohl durch EBV-Reaktivierung als auch durch andere Wirkstoffe verursacht wurden8. B-Zellen sind zuerst an IM beteiligt, da EBV-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche präsentiert werden. Al Tabaa et al. fanden heraus, dass B-Zellen während IM9 polyklonisch aktiviert und in Plasmablasten (CD19+, CD27+ und CD20− sowie CD138-Zellen) und Plasmazellen (CD19+, CD27+ und CD20 und CD138+) differenziert wurden. Darüber hinaus fanden Zhong et al. heraus, dass die Monozytenmarker CD14 und CD64 bei CAEBV hochreguliert waren, was darauf hindeutet, dass Monozyten eine wichtige Rolle bei der zellulären Immunantwort von CAEBV durch Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) und hyperaktive Phagozytose spielen könnten7. Alka et al. charakterisierten das Transkriptom von MACS sortierten CD56dim CD16+ NK-Zellen von vier Patienten von IM oder HL und fanden heraus, dass NK-Zellen sowohl aus IM als auch aus HL eine herunterregulierte angeborene Immunität und Chemokin-Signalgene aufwiesen, die für die Hyporeagibilität von NK-Zellen verantwortlich sein könnten10. Darüber hinaus analysierten Greenough et al. die Genexpression von sortierten CD8+ T-Zellen von 10 PBMCs von Personen mit IM. Sie berichteten, dass ein großer Teil der CD8+ T-Zellen in IM virusspezifisch war, aktiviert, sich teilte und darauf vorbereitet war, Effektoraktivitäten auszuüben11. Sowohl T-Zell-vermittelte, EBV-spezifische Reaktionen als auch NK-Zell-vermittelte, unspezifische Reaktionen spielen eine wesentliche Rolle während der primären EBV-Infektion. Diese Studien untersuchten jedoch nur die Transkriptomergebnisse der vielfältigen Mischung von Immunzellen oder nur eine bestimmte Subpopulation von Lymphozyten, was für den umfassenden Vergleich der molekularen Eigenschaften und Funktionen verschiedener Immunzellsubpopulationen bei Kindern mit IM im gleichen Krankheitszustand nicht ausreicht.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, die immunmagnetische Beads und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) kombiniert, um definierte Immunzellsubpopulationen von PBMCs (Monozyten, CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen) zu isolieren und zu analysieren. Mit dieser Methode können magnetisch und fluoreszenzmarkierte Zellen mit einem Magnetabscheider und FACS gereinigt oder mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. RNA kann aus den gereinigten Zellen für die Transkriptomsequenzierung extrahiert werden. Diese Methode wird die Charakterisierung und Genexpression verschiedener Immunzellen in den gleichen Krankheitszuständen von Personen mit IM ermöglichen, was unser Verständnis der Immunpathologie der EBV-Infektion erweitern wird.

Protocol

Blutproben wurden von Patienten mit IM (n = 3), gesunden EBV-Trägern (n = 3) und EBV-nicht infizierten Kindern (n = 3) entnommen. Freiwillige wurden vom Beijing Children’s Hospital der Capital Medical University rekrutiert und alle Studien wurden ethisch genehmigt. Die ethische Genehmigung wurde von der Ethikkommission des Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, erhalten (Zulassungsnummer: [2021]-E-056-Y). Auf die Einwilligung der Patienten nach Aufklärung wurde verzichtet, da in der Studie nur die ver…

Representative Results

Referenz der Gating-StrategieDie Gating-Strategie, die zur Sortierung der vier Lymphozyten-Subpopulationen verwendet wird, ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, werden Lymphozyten (P1) in einem Punktdiagramm ausgewählt, das die Granulosität (SSC-A) im Vergleich zur Größe (FSC-A) zeigt. Dann werden einzelne Zellen (P2) in einem Punktdiagramm ausgewählt, das die Größe (FSC-A) im Vergleich zur Vorwärtsstreuung (FSC-H) zeigt, während Dublettenzellen ausgeschl…

Discussion

Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode dar, um periphere Blutimmunzellsubpopulationen zu sortieren. In dieser Studie wurden venöse Blutproben von Patienten mit IM, gesunden EBV-Trägern und EBV-nicht infizierten Kindern als Forschungsziel ausgewählt. Diese Arbeit mit dem peripheren Blut von IM-Patienten konzentriert sich hauptsächlich auf die Analyse und Bestimmung der Anteile verschiedener Zelluntergruppen durch Mehrfarben-Durchflusszytometrie. Die Transkriptomsequenzierung wird hauptsächlich für den Nachw…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82002130), der Beijing Natural Science Foundation (7222059) und dem CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026) unterstützt.

Materials

APC anti-human CD16 Biolegend 302012 Fluorescent antibody 
APC anti-human CD56 (NCAM) Biolegend 362504 Fluorescent antibody 
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Biolegend 344616 Fluorescent antibody 
Automated cell counter BIO RAD TC20 Cell count
BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) Becton, Dickinson and Company 644832 Cell sort
CD14 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201 microbeads
Cell ctng slides BIO RAD 1450016 Cell count
Centrifuge tubes Falcon 35209715 15 mL centrifuge tube
EDTA (≥99%, BioPremium) Beyotime ST1303 EDTA
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes Becton, Dickinson and Company  367862  EDTA anticoagulant tubes
FITC anti-human CD19 Biolegend 302206 Fluorescent antibody 
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000-044 Fetal Bovine Serum
 High-speed centrifuge Sigma  3K15 Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
 High-speed centrifuge Eppendorf 5424R Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Human lymphocyte separation medium Dakewe DKW-KLSH-0100 Ficoll-Paque
LS Separation columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Separation columns
Microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C 1.5 mL microcentrifuge tube
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302 Magnetic bead separator
PE anti-human CD8 Biolegend 344706 Fluorescent antibody 
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 Biolegend 344808 Fluorescent antibody 
Phosphate Buffered Saline (PBS) BI 02-024-1ACS PBS
Polystyrene round bottom tubes Falcon 352235 5 mL tube for FACS flow cytometer
TRIzol reagent Ambion 15596024 Lyse cells for RNA extraction
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit Beyotime C0011 Trypan Blue Staining

References

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Cite This Article
Zhang, L., Liu, M., Zhang, M., Ai, J., Tian, J., Wang, R., Xie, Z. Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis. J. Vis. Exp. (187), e64212, doi:10.3791/64212 (2022).

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