Отделение субпопуляций иммунных клеток в образцах периферической крови у детей с инфекционным мононуклеозом

Вирус Эпштейна-Барра (EBV), γ-герпесвирус, также известный как вирус герпеса человека типа 4, повсеместно распространен в человеческой популяции и устанавливает пожизненную латентную инфекцию у более чем 90% взрослого населения¹. Большинство первичных инфекций ВЭБ происходит в детском и подростковом возрасте, причем у части пациентов проявляется инфекционный мононуклеоз (IM)², демонстрируя характерную иммунопатологию, включая активированный иммунный ответ с CD8 ⁺ Т-клетками в крови и преходящую пролиферацию инфицированных ВЭБ В клеток в ротоглотке³. Курс ВМ может длиться 2–6 недель и большинство пациентов хорошо выздоравливают⁴. Тем не менее, у некоторых людей развиваются стойкие или рецидивирующие IM-подобные симптомы с высокой заболеваемостью и смертностью, которые классифицируются как хроническая активная инфекция ВЭБ (CAEBV)⁵. Кроме того, ВЭБ является важным онкогенным вирусом, который тесно связан с различными злокачественными новообразованиями, включая эпителиоидные и лимфоидные злокачественные новообразования, такие как аназофарингеальная карцинома, лимфома Беркитта, лимфома Ходжкина (HL) и Т/NK-клеточная лимфома⁶. Хотя ВЭБ изучается уже более 50 лет, его патогенез и механизм, с помощью которого он индуцирует пролиферацию лимфоцитов, не были полностью выяснены.

В нескольких исследованиях изучались молекулярные сигнатуры иммунопатологии ВЭБ-инфекции путем секвенирования транскриптома. Zhong et al. проанализировали профилирование цельного транскриптома мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) у китайских детей с IM или CAEBV, чтобы обнаружить, что cd8 ⁺ Т-клеточная экспансия была преимущественно обнаружена в группе IM⁷, предполагая, что CD8 ^{+ Т-клетки} могут играть важную роль в IM. Аналогичным образом, другое исследование обнаружило более низкие пропорции специфичных для ВЭБ цитотоксических Т- и CD19⁺ В-клеток и более высокий процент CD8^{+ Т-клеток} у пациентов с ВМ, вызванных первичной инфекцией ВЭБ, чем у пациентов с ВМ, вызванной как реактивацией ВЭБ, так и другими агентами⁸. В-клетки впервые участвуют в IM, потому что рецепторы EBV представлены на их поверхности. Al Tabaa et al. обнаружили, что В-клетки были поликлонально активированными и дифференцированными интоплазмабластами (CD19⁺, CD27⁺ и CD20⁻ и CD138⁻ клетками) и плазматическими клетками (CD19⁺, CD27⁺ и CD20⁻ и CD138⁺) во время IM⁹. Кроме того, Zhong et al. обнаружили, что моноцитарные маркеры CD14 и CD64 были повышены в CAEBV, предполагая, что моноциты могут играть важную роль в клеточном иммунном ответе CAEBV через антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и гиперактивный фагоцитоз⁷. Alka et al. охарактеризовали транскриптом MACS,отсортированных CD56^dim CD16 ⁺ NK-клеток от четырех пациентов IM или HL и обнаружили, что NK-клетки как из IM, так и из HL имели сниженный врожденный иммунитет и сигнальные гены хемокина, которые могут быть ответственны за гипочувствительность NK-клеток¹⁰. Кроме того, Greenough et al. проанализировали экспрессию генов отсортированных CD8⁺ Т-клеток из 10 PBMCs людей с IM. Они сообщили, что большая часть CD8⁺ Т-клеток в IM была вирус-специфичной, активированной, делящейся и праймированной для оказания эффекторной активности¹¹. Как Т-клеточно-опосредованные, специфические для ВЭБ ответы, так и NK-клеточные, неспецифические ответы играют важную роль во время первичной инфекции ВЭБ. Однако в этих исследованиях изучались только результаты транскриптома разнообразной смеси иммунных клеток или только определенной субпопуляции лимфоцитов, чего недостаточно для всестороннего сравнения молекулярных характеристик и функций различных субпопуляций иммунных клеток у детей с ВМ в одном и том же болезненном состоянии.

В данной статье описывается метод, который сочетает в себе иммуномагнитные шарики и флуоресцентно-активированную сортировку клеток (FACS) для выделения и анализа определенных субпопуляций иммунных клеток PBMCs (моноциты, CD4 ⁺ Т-клетки, CD8 ^{+ Т-клетки} , В-клетки и NK-клетки). Используя этот метод, магнитные и флуоресцентно меченые клетки могут быть очищены с помощью магнитного сепаратора и FACS или проанализированы с помощью проточной цитометрии. РНК может быть извлечена из очищенных клеток для секвенирования транскриптома. Этот метод позволит характеризовать и экспрессию генов различных иммунных клеток в одних и тех же состояниях заболевания людей с IM, что расширит наше понимание иммунопатологии инфекции EBV.