Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi
Summary
Soyma-leke tekniği, kalınlığı azaltmak, numune konsantrasyonunu artırmak ve görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için çok katmanlı ve konsantre biyolojik numunelerin tek katmanlara ayrılmasını sağlayan bir kriyo-EM ızgara hazırlama yöntemidir.
Abstract
Soyulmuş leke kriyo-EM ızgara hazırlama tekniği, çok katmanlı numunelerin katmanlarında bir azalma sağlamak amacıyla önemli ölçüde modifiye edilmiş bir geri enjeksiyon yöntemidir. Dalma donmasından önce katmanların bu şekilde çıkarılması, numune kalınlığının kriyo-EM veri toplama için uygun bir seviyeye düşürülmesine, numune düzlüğünün iyileştirilmesine ve görüntü işlemenin kolaylaştırılmasına yardımcı olabilir. Soyma lekesi tekniği, çok katmanlı membranların tek katmanlara, katmanlı 2D kristallerin tek kristallere ve çözünür proteinlerin istiflenmiş, tabaka benzeri yapılarının da aynı şekilde tek katmanlara ayrılmasına izin verir. Bu tür numunelerin yüksek numune kalınlığı, özellikle mikroskop aşamasının veri toplama için eğilmesi gerektiğinde, kriyo-EM veri toplama ve kriyo-EM görüntü işleme için sıklıkla aşılmaz sorunlar ortaya çıkarmaktadır. Ayrıca, bu numunelerden herhangi birinin yüksek konsantrasyonlu ızgaraları, ızgara hazırlamadan önce numune konsantrasyonu artırılabildiğinden ve soyma lekesi tekniği, tek katmanlı numunenin yoğun bir dağılımına neden olacak şekilde ayarlanabildiğinden, verimli veri toplama için hazırlanabilir.
Introduction
Soyma lekesi tekniği, kriyo-EM 2D ve 3D veri toplama için uygun derecede ince numuneler elde etmek ve görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için istiflenmiş iki boyutlu membran proteinleri kristallerini tek katmanlara ayırmak için geliştirilmiştir1. Protokol, diğer çok katmanlı numune tipleri için ve ayrıca Z’deki kalınlığı arttırmadan ızgarada her iki numune tipinin de yüksek numune konsantrasyonlarına ulaşmak için benzer şekilde uygundur.
Numune katmanlarının bir katmana indirgenmesi, kılcal basınç ve kesme kuvvetlerinin bir kombinasyonunun, geri enjeksiyon yöntemi2’yi önemli ölçüde genişleten ve değiştiren bir protokolde uygulanmasıyla elde edilir. İlk lekeleme adımı, geri enjeksiyon yöntemindeki 20-25μm filtre kağıdı gözenek boyutu yerine mikron altı üzerinde lekeleme sırasında sıkı sandviçleme ve karbon filme ve çok katmanlı numunenin her iki tarafında bir ızgara çubuğuna yapışma ile sonuçlanır. Tek bir tabakanın ayrılması veya soyulması, ızgara bir trehaloz damlasına dikey olarak bastırıldıktan sonra sandviçlenmiş tabakaların ayrılmasının zorlanması üzerine gerçekleşir ve karbon filmi ızgara çubuğundan uzaklaştırır (Şekil 1). Karbon filmin ızgara çubuğu ile orijinal temas noktasından uzağa yeniden konumlandırılması, ızgara bir kez daha mikron altı filtre kağıdı üzerinde lekelendiğinde bir sonraki adımda gerçekleşir. Bu adımların yineleme sayısı belirli örnekler için en iyi duruma getirilebilir. Ayrıca, protokol, Z’de agregasyondan kaçınırken numune konsantrasyonlarını arttırmak için kullanılabilir. ızgara çubuğuna ve karbon filme yapışmanın yanı sıra güçlü ayırmaya bağlı olması nedeniyle, bu yaklaşım bazı hassas ve / veya kararsız proteinler ve protein kompleksleri gibi oldukça kırılgan moleküller için uygun olmayabilir.
Soyma lekesi tekniği ne özel ekipman ne de pahalı malzemeler gerektirir. Bununla birlikte, belirli numunelere uygulanabilirlik, biyolojik parametrelerin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesini gerektirecektir. Düzlüğü sağlamak için karbon filmi gerektiğinden, 2D kristaller için karar daha kolaydır, ancak soyma-leke tekniği ile manipülasyon, numunenin biyolojik bütünlüğünü veya kristalin sırasını etkileyebilir. Soyulma lekesi tekniğinin tek parçacıklara uygunluğu, karbon film gerektiren ve manipülasyona kararlı olanlarla sınırlıdır ve bunlar için test edilebilir. Katmanlar arasında kritik biyolojik etkileşime sahip örnekler, bu tür etkileşimlerin bozulması nedeniyle soyma-leke tekniği yardımıyla karakterizasyon için uygun olmayabilir.
Soyma-leke tekniği (“soyma-leke”), oda sıcaklığında TEM tarafından negatif lekeli veya lekesiz numunelerle test edilerek ve taranarak en hızlı şekilde optimize edilir. Optimum sayıda soyulma-leke yinelemesi belirlendikten sonra, vitrifikasyondan önce kalınlığı kontrol etme süresi belirlenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Soyma lekesi, kriyo-EM veri toplama ve görüntü işleme için çok katmanlı 2D kristallerin ve benzeri numunelerin istiflenmesinin ve kalınlığının üstesinden gelmek için güçlü bir yöntemdir. Soyma lekesinin kullanımına ilişkin bir karar, numunenin biyolojik parametrelerine dayanacak ve ayrıca bir 3D kriyo-EM modeli mevcut olduğunda değerlendirme gerektirecektir. Temaslıların biyolojik önemi ve temas bölgelerinin potansiyel esnekliği bu değerlendirmede özellikle önemli olacaktır.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmanın bir kısmı NIH hibesi HL090630 (ISK) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
