La tecnica peel-blot: un metodo di preparazione dei campioni crio-EM per separare singoli strati da campioni biologici multistrato o concentrati
Summary
La tecnica peel-blot è un metodo di preparazione della griglia crio-EM che consente la separazione di campioni biologici multistrato e concentrati in singoli strati per ridurre lo spessore, aumentare la concentrazione del campione e facilitare l’elaborazione delle immagini.
Abstract
La tecnica di preparazione della griglia crio-EM peel-blot è un metodo di back-injection significativamente modificato con l’obiettivo di ottenere una riduzione degli strati di campioni multistrato. Questa rimozione degli strati prima del congelamento a tuffo può aiutare a ridurre lo spessore del campione a un livello adatto alla raccolta di dati crio-EM, migliorando la planarità del campione e facilitando l’elaborazione delle immagini. La tecnica peel-blot consente la separazione di membrane multilamellari in singoli strati, di cristalli 2D stratificati in singoli cristalli e di strutture impilate simili a fogli di proteine solubili da separare allo stesso modo in singoli strati. L’elevato spessore del campione di questi tipi di campioni pone spesso problemi insormontabili per la raccolta di dati crio-EM e l’elaborazione di immagini crio-EM, specialmente quando lo stadio del microscopio deve essere inclinato per la raccolta dei dati. Inoltre, le griglie di alte concentrazioni di uno qualsiasi di questi campioni possono essere preparate per una raccolta efficiente dei dati poiché la concentrazione del campione prima della preparazione della griglia può essere aumentata e la tecnica peel-blot regolata per ottenere una distribuzione densa di campione a strato singolo.
Introduction
La tecnica peel-blot è stata sviluppata per separare cristalli bidimensionali impilati di proteine di membrana in singoli strati per ottenere campioni adeguatamente sottili per la raccolta di dati crio-EM 2D e 3D e facilitare l’elaborazione delle immagini1. Il protocollo è adatto allo stesso modo per altri tipi di campioni multilamellari e per ottenere elevate concentrazioni di campioni di entrambi i tipi di campioni sulla griglia senza aumentare lo spessore in Z.
La riduzione degli strati di campione a uno strato si ottiene applicando una combinazione di pressione capillare e forze di taglio in un protocollo che estende e modifica sostanzialmente il metodo di back-injection2. Una prima fase di blotting si traduce in uno stretto sandwiching e aderenza al film di carbonio e una barra della griglia su entrambi i lati del campione multistrato durante la blotting su submicron piuttosto che la dimensione dei pori della carta da filtro di 20-25 μm nel metodo di back-injection. La separazione, o peeling, di un singolo strato avviene forzando la separazione degli strati a sandwich una volta che la griglia viene premuta verticalmente su una goccia di trealosio, forzando il film di carbonio lontano dalla barra della griglia (Figura 1). Il riposizionamento del film di carbonio lontano dal punto di contatto originale con la barra della griglia avviene nella fase successiva, quando la griglia viene nuovamente cancellata su carta da filtro submicron. Il numero di iterazioni di questi passaggi può essere ottimizzato per campioni specifici. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per aumentare le concentrazioni del campione evitando l’aggregazione in Z. A causa della dipendenza dall’aderenza alla barra della griglia e al film di carbonio, nonché della separazione forzata, questo approccio potrebbe non essere adatto per molecole altamente fragili come alcune proteine delicate e / o instabili e complessi proteici.
La tecnica peel-blot non richiede attrezzature specializzate né costose forniture. L’applicabilità a campioni specifici richiederà, tuttavia, un’attenta considerazione dei parametri biologici. La decisione è più facile per i cristalli 2D poiché è necessaria una pellicola di carbonio per garantire la planarità, ma la manipolazione tramite la tecnica peel-blot può influire sull’integrità biologica del campione o sull’ordine cristallino. L’idoneità della tecnica peel-blot a singole particelle è limitata e può essere testata per quelle che richiedono pellicola di carbonio e sono stabili alla manipolazione. I campioni con interazioni biologiche critiche tra gli strati potrebbero non essere adatti per la caratterizzazione con l’aiuto della tecnica peel-blot a causa dell’interruzione di tali interazioni.
La tecnica peel-blot (“peel-blot”) viene ottimizzata più rapidamente testando e vagliando con macchie negative o campioni non colorati da TEM a temperatura ambiente. Una volta identificato il numero ottimale di iterazioni peel-blot, è possibile determinare il tempo necessario per controllare lo spessore prima della vetrificazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il peel-blot è un metodo potente per superare l’impilamento e lo spessore di cristalli 2D multistrato e campioni simili per la raccolta di dati crio-EM e l’elaborazione delle immagini. Una decisione sull’uso del peel-blot sarà basata sui parametri biologici del campione e richiederà anche una valutazione una volta che sarà disponibile un modello crio-EM 3D. L’importanza biologica dei contatti e la potenziale flessibilità delle regioni di contatto saranno particolarmente importanti in questa valutazione.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Parte di questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH HL090630 (ISK).
Materials
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
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