Summary

Préparation de particules de noyau de nucléosomes complexées avec des facteurs de réparation de l’ADN pour la détermination structurelle de la cryo-microscopie électronique

Published: August 17, 2022
doi:

Summary

Ce protocole décrit en détail la préparation des complexes nucléosomiques à l’aide de deux méthodes de préparation des échantillons pour la congélation des grilles TEM.

Abstract

La réparation de l’ADN dans le contexte de la chromatine est mal comprise. Des études biochimiques utilisant des particules de noyau de nucléosome, l’unité répétitive fondamentale de la chromatine, montrent que la plupart des enzymes de réparation de l’ADN éliminent les dommages à l’ADN à des taux réduits par rapport à l’ADN libre. Les détails moléculaires sur la façon dont les enzymes de réparation par excision de base (BER) reconnaissent et éliminent les dommages à l’ADN dans les nucléosomes n’ont pas été élucidés. Cependant, les données biochimiques BER des substrats nucléosomales suggèrent que le nucléosome présente différentes barrières structurelles en fonction de l’emplacement de la lésion de l’ADN et de l’enzyme. Cela indique que les mécanismes employés par ces enzymes pour éliminer les dommages à l’ADN dans l’ADN libre peuvent être différents de ceux employés dans les nucléosomes. Étant donné que la majorité de l’ADN génomique est assemblée en nucléosomes, des informations structurelles sur ces complexes sont nécessaires. À ce jour, la communauté scientifique ne dispose pas de protocoles détaillés pour réaliser des études structurelles techniquement réalisables de ces complexes. Ici, nous fournissons deux méthodes pour préparer un complexe de deux enzymes BER génétiquement fusionnées (polymérase β et endonucléase AP1) liées à un espace mononucléotidique près de l’entrée-sortie du nucléosome pour la détermination structurelle de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM). Les deux méthodes de préparation des échantillons sont compatibles pour vitrifier les grilles de qualité par congélation. Ce protocole peut être utilisé comme point de départ pour préparer d’autres complexes nucléosomiques avec différents facteurs BER, facteurs de transcription pionniers et enzymes modifiant la chromatine.

Introduction

L’ADN eucaryote est organisé et compacté par les protéines histones, formant de la chromatine. La particule centrale du nucléosome (NCP) constitue l’unité répétitive fondamentale de la chromatine qui régule l’accessibilité aux protéines de liaison à l’ADN pour la réparation, la transcription et la réplication de l’ADN1. Bien que la première structure cristalline en rayons X du NCP ait été résolue pour la première fois il y a plus de deux décennies2 et que de nombreuses autres structures du NCP aient été publiées depuis 3,4,5,6, les mécanismes de réparation de l’ADN dans les substrats nucléosomaux n’ont pas encore été délimités. La découverte des détails moléculaires sous-jacents à la réparation de l’ADN dans la chromatine nécessitera une caractérisation structurale des composants participants afin de comprendre comment les caractéristiques structurelles locales du PCN régulent les activités de réparation de l’ADN. Ceci est particulièrement important dans le contexte de la réparation par excision de base (BER) étant donné que les études biochimiques avec des enzymes BER suggèrent des mécanismes uniques de réparation de l’ADN dans les nucléosomes qui dépendent des exigences structurelles spécifiques à l’enzyme pour la catalyse et de la position structurelle de la lésion de l’ADN dans le nucléosome 7,8,9,10,11,12,13 . Étant donné que le BER est un processus vital de réparation de l’ADN, il existe un intérêt considérable à combler ces lacunes tout en établissant un point de départ à partir duquel d’autres études structurelles techniquement réalisables impliquant des complexes nucléosomaux pertinents peuvent être réalisées.

Cryo-EM devient rapidement la méthode de choix pour résoudre la structure tridimensionnelle (3D) de complexes dont la préparation à grande échelle d’échantillons homogènes est difficile. Bien que la conception et la purification de NCP complexés avec un facteur de réparation de l’ADN (NCP-DRF) nécessiteront probablement une optimisation sur mesure, la procédure présentée ici pour générer et congeler un complexe NCP-DRF stable fournit des détails sur la façon d’optimiser la préparation de l’échantillon et de la grille cryo-EM. Deux workflows (non mutuellement exclusifs) illustrés à la figure 1 et les détails spécifiques du protocole identifient les étapes critiques et fournissent des stratégies pour optimiser ces étapes. Ce travail propulsera le domaine de la chromatine et de la réparation de l’ADN dans une direction où il devient techniquement possible de compléter les études biochimiques par des études structurales pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la réparation de l’ADN nucléosomique.

Protocol

1. Assembler les particules du noyau du nucléosome par dialyse sel-gardient NOTE: La préparation de particules de noyau de nucléosome à l’aide de protéines histones recombinantes pour des études structurales a été décrite en détail par d’autres 14,15,16. Suivre la purification des histones recombinantes de X. laevis et de l’assemblage octomère d’histones déc…

Representative Results

Des NCP correctement assemblés (Figure 2) ont été utilisés pour fabriquer un complexe avec une protéine de fusion recombinante de MBP-Polβ-APE1 (Figure 3). Pour déterminer le rapport NCP / MBP-Polβ-APE1 pour former un complexe stable, nous avons effectué des tests de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) (Figure 4), qui ont montré une bande décalée individuellement du NCP avec un excès molaire 5 fois de M…

Discussion

Un protocole spécifique pour purifier le facteur de réparation de l’ADN dépendra de l’enzyme d’intérêt. Cependant, il existe certaines recommandations générales, notamment l’utilisation de méthodes recombinantes pour l’expression et la purification des protéines18; si la protéine d’intérêt est trop petite (<50 kDa), la détermination de la structure par cryo-EM était presque impossible jusqu’à plus récemment grâce à l’utilisation de systèmes de fusion<sup class="x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Mario Borgnia du noyau cryo-EM de l’Institut national des sciences de la santé environnementale et le Dr Joshua Strauss de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill pour leur mentorat et leur formation à la préparation de la grille cryo-EM. Nous remercions également le Dr Juliana Mello Da Fonseca Rezende pour son assistance technique dans les premières étapes de ce projet. Nous apprécions la contribution et le soutien clés du regretté Dr Samuel H. Wilson et des membres de son laboratoire, en particulier le Dr Rajendra Prasad et le Dr Joonas Jamsen pour la purification du complexe APE1-Polβ génétiquement fusionné. La recherche a été soutenue par le Programme de recherche intra-muros des National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [numéros de subvention Z01ES050158, Z01ES050159 et K99ES031662-01].

Materials

1 M HEPES; pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15630080
1 M MgCl2 Thermo Fisher Scientific AM9530G
10x TBE Bio-rad 1610733
25% glutaraldehyde Fisher Scientific 50-262-23
3 M KCl Thermo Fisher Scientific 043398.K2
491 prep cell Bio-rad 1702926
Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) Millipore Sigma Z717185
Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) Millipore Sigma UFC8030
AutoGrid Tweezers Ted Pella 47000-600
Automatic Plunge Freezer Leica Leica EM GP
C-1000 touch thermocycler Bio-rad 1851148
C-clips and rings Thermo Fisher 6640–6640
Clipping station SubAngostrom SCT08
Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) Fisher Scientific 15370752
Diamond Tweezers Techni-Pro 758TW0010
dsDNA Integrated DNA techonologies N/A
FEI Titan Krios Thermo Fisher KRIOSG4TEM
FPLC purification system AKTA Pure 29018224
Fraction collector Model 2110 Bio-rad 7318122
Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000S
Grid Boxes SubAngostrom PB-E
Grid Storage Accessory Pack SubAngostrom GSAX
Liquid Ethane N/A N/A
Liquid Nitrogen N/A N/A
Minipuls 3 peristaltic two-head pump Gilson F155008
Nanodrop Thermo Fisher Scientific ND-2000
Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels Thermo Fisher Scientific EC6695BOX
Pipetman Gilson FA10002M
Pipette tips (VWR) Low Retention VWR 76322-528
Polyacrylamide gel solution (37.5:1) Bio-rad 1610158
polyethylene glycol (PEG) Millipore Sigma P4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500 Millipore Sigma PURX35050
Purified recombinant DNA repair factor N/A N/A
R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids Quantifoil N1-C14nCu30-01
Recombinant histone octamer N/A N/A
Spring clipping tools SubAngostrom CSA-01
Superdex 200 column 10/300 Millipore Sigma GE28-9909-44
Transmission Electron Microscope Thermo Fisher Talos Arctica 200 kV
Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I Ted Pella 47000-500
UltraPure Glycerol Thermo Fisher Scientific 15514011
Vitrobot Thermo Fisher Mark IV System
Whatman Filter paper (55 mM) Cytiva 1005-055
Xylene cyanol Thermo Fisher Scientific 440700500
Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL Thermo Fisher Scientific 89877

References

  1. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
  4. Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
  5. Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
  6. McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
  7. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
  8. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
  9. Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. 생화학. 58 (35), 3646-3655 (2019).
  10. Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
  11. Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
  12. Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
  13. Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
  14. Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
  15. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
  16. McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
  17. Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
  18. Burgess, R. R. D., Murray, P. . Guide to Protein Purification. 463, (2009).
  19. Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
  20. Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
  21. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
  22. Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
  23. Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).

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Rodriguez, Y., Butay, K. J., Sharma, K., Viverette, E., Wilson, S. H. Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination. J. Vis. Exp. (186), e64061, doi:10.3791/64061 (2022).

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