초저온 전자 현미경 구조 결정을 위한 DNA 복구 인자와 복합체화된 뉴클레오솜 코어 입자의 준비
Summary
이 프로토콜은 TEM 그리드 동결을 위한 두 가지 샘플 준비 방법을 사용하여 뉴클레오솜 복합체의 준비를 자세히 설명합니다.
Abstract
염색질의 맥락에서 DNA 복구는 잘 알려져 있지 않습니다. 염색질의 기본 반복 단위인 뉴클레오솜 코어 입자를 사용한 생화학적 연구에 따르면 대부분의 DNA 복구 효소는 유리 DNA에 비해 감소된 속도로 DNA 손상을 제거합니다. 염기 절제 복구(BER) 효소가 뉴클레오솜에서 DNA 손상을 인식하고 제거하는 방법에 대한 분자적 세부 사항은 밝혀지지 않았습니다. 그러나 뉴클레오솜 기질의 생화학적 BER 데이터는 뉴클레오솜이 DNA 병변의 위치와 효소에 따라 다른 구조적 장벽을 제시함을 시사합니다. 이것은 유리 DNA에서 DNA 손상을 제거하기 위해 이러한 효소가 사용하는 메커니즘이 뉴클레오솜에 사용되는 메커니즘과 다를 수 있음을 나타냅니다. 대부분의 게놈 DNA가 뉴클레오솜으로 조립된다는 점을 감안할 때 이러한 복합체의 구조적 정보가 필요합니다. 현재까지 과학계는 이러한 복합체에 대해 기술적으로 실현 가능한 구조 연구를 수행하기위한 상세한 프로토콜이 부족합니다. 여기에서는 초저온 전자 현미경(Cryo-EM) 구조 결정을 위해 뉴클레오솜의 입구-출구 근처의 단일 뉴클레오티드 갭에 결합된 두 개의 유전적으로 융합된 BER 효소(중합효소 β 및 AP 엔도뉴클레아제1)의 복합체를 제조하는 두 가지 방법을 제공합니다. 두 가지 시료 전처리 방법 모두 플런지 냉동을 통해 품질 그리드를 유리화하는 데 적합합니다. 이 프로토콜은 다른 BER 인자, 선구자 전사 인자 및 염색질 변형 효소를 가진 다른 뉴클레오솜 복합체를 준비하기 위한 출발점으로 사용할 수 있습니다.
Introduction
진핵 생물 DNA는 히스톤 단백질에 의해 조직되고 압축되어 염색질을 형성합니다. 뉴클레오솜 코어 입자(NCP)는 DNA 복구, 전사 및 복제를 위한 DNA 결합 단백질에 대한 접근성을 조절하는 염색질의 기본 반복 단위를 구성합니다1. NCP의 첫 번째 X선 결정 구조가 20여 년 전에 처음 해결되었지만2 3,4,5,6 이후 NCP의 더 많은 구조가 발표되었지만 뉴클레오솜 기질의 DNA 복구 메커니즘은 아직 설명되지 않았습니다. 염색질에서 DNA 복구의 기본 분자 세부 사항을 밝히려면 NCP의 국소 구조적 특징이 DNA 복구 활동을 조절하는 방법을 이해하기 위해 참여 구성 요소의 구조적 특성화가 필요합니다. 이것은 BER 효소를 사용한 생화학적 연구가 촉매 작용에 대한 효소 특이적 구조 요구 사항 및 뉴클레오솜 내 DNA 병변의 구조적 위치에 의존하는 뉴클레오솜의 고유한 DNA 복구 메커니즘을 제안한다는 점을 감안할 때 염기 절제 복구(BER)의 맥락에서 특히 중요합니다 7,8,9,10,11,12,13 . BER이 중요한 DNA 복구 과정이라는 점을 감안할 때, 이러한 격차를 메우는 동시에 관련 뉴클레오솜 복합체와 관련된 기술적으로 실현 가능한 다른 구조 연구를 수행할 수 있는 출발점을 설정하는 데 상당한 관심이 있습니다.
Cryo-EM은 균질 시료의 대규모 전처리가 어려운 복합체의 3차원 (3D) 구조를 해결하기 위한 방법으로 빠르게 자리잡고 있습니다. DNA 복구 인자(NCP-DRF)와 복합체를 이루는 NCP의 설계 및 정제에는 맞춤형 최적화가 필요할 수 있지만, 안정적인 NCP-DRF 복합체를 생성 및 동결하기 위해 여기에 제시된 절차는 시료 및 Cryo-EM 그리드 준비를 최적화하는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다. 그림 1에 표시된 두 개의 워크플로(상호 배타적이지 않음)와 프로토콜의 특정 세부 정보는 중요한 단계를 식별하고 이러한 단계를 최적화하기 위한 전략을 제공합니다. 이 연구는 뉴클레오솜 DNA 복구의 분자 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 생화학적과 구조적 연구를 보완하는 것이 기술적으로 실현 가능한 방향으로 염색질 및 DNA 복구 분야를 추진할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA 복구 인자를 정제하기 위한 특정 프로토콜은 관심 효소에 따라 달라집니다. 그러나, 단백질 발현 및 정제를 위한 재조합 방법의 사용을 포함하여 몇 가지 일반적인 권장 사항이 있다18; 관심 단백질이 너무 작으면(<50kDa), Cryo-EM에 의한 구조 결정은 융합 시스템(19), 나노바디 결합 스캐폴드(nanobody-binding scaffolds)20 및 이미징 전략?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
미국 국립환경보건과학연구소(National Institute of Environmental Health Sciences)의 Cryo-EM 코어의 Mario Borgnia 박사와 채플힐에 있는 노스캐롤라이나 대학교(University of North Carolina at Chapel Hill)의 Joshua Strauss 박사에게 Cryo-EM 그리드 준비에 대한 멘토링과 교육에 감사드립니다. 또한 이 프로젝트의 초기 단계에서 기술 지원을 해주신 Juliana Mello Da Fonseca Rezende 박사에게도 감사드립니다. 우리는 고(故) Samuel H. Wilson 박사와 그의 연구실 구성원, 특히 유전적으로 융합된 APE1-Polβ 복합체의 정제를 위해 Dr. Rajendra Prasad와 Dr. Joonas Jamsen의 주요 공헌과 지원에 감사드립니다. 연구는 국립 보건원, 국립 환경 보건 과학 연구소의 교내 연구 프로그램[보조금 번호 Z01ES050158, Z01ES050159 및 K99ES031662-01]의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640–6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
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