قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين / الديوتيريوم بالمللي ثانية لدراسة الديناميات الهيكلية ألفا سينوكلين في ظل الظروف الفسيولوجية
Summary
تؤثر المجموعة الهيكلية لألفا سينوكلين أحادي اللون على وظيفتها الفسيولوجية وخصائصها الفيزيائية الكيميائية. يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين / الديوتيريوم بالمللي ثانية وتحليلات البيانات اللاحقة لتحديد المعلومات التوافقية عن مونومر هذا البروتين المضطرب جوهريا في ظل الظروف الفسيولوجية.
Abstract
ألفا سينوكلين (aSyn) هو بروتين مضطرب في جوهره ، حيث تكون مجاميع الألياف وفيرة في أجسام ليوي والأعصاب ، والتي هي السمات المميزة لمرض باركنسون. ومع ذلك ، فإن الكثير من نشاطه البيولوجي ، وكذلك تجميعه ، ينطوي بشكل مركزي على شكل مونومر قابل للذوبان من البروتين. يتطلب توضيح الآليات الجزيئية لبيولوجيا aSyn والفيزيولوجيا المرضية طرقا عالية الحل هيكليا وحساسة للظروف البيولوجية. هياكلها المستقرة في الأصل تجعل aSyn الأحادي المستعصي على العديد من تقنيات البيولوجيا الهيكلية. هنا ، يتم وصف تطبيق أحد هذه النهج: قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين / الديوتيريوم (HDX-MS) على مقياس زمني بالمللي ثانية لدراسة البروتينات ذات الاستقرار الديناميكي الحراري المنخفض وعوامل الحماية الضعيفة ، مثل aSyn. على النطاق الزمني للميلي ثانية ، تحتوي بيانات HDX-MS على معلومات حول إمكانية الوصول إلى المذيبات والبنية المستعبدة بالهيدروجين ل aSyn ، والتي يتم فقدانها في أوقات وضع العلامات الأطول ، مما يؤدي في النهاية إلى دقة هيكلية تصل إلى مستوى الأحماض الأمينية. لذلك ، يمكن أن يوفر HDX-MS معلومات بدقة هيكلية وزمنية عالية حول الديناميات التوافقية والديناميكا الحرارية ، والتفاعلات داخل الجزيئات وفيما بينها ، والتأثير الهيكلي للطفرات أو التغييرات في الظروف البيئية. على الرغم من أنه قابل للتطبيق على نطاق واسع ، إلا أنه تم توضيح كيفية الحصول على قياسات HDX-MS بالمللي ثانية وتحليلها وتفسيرها في aSyn الأحادية.
Introduction
مرض باركنسون (PD) هو مرض تنكسي عصبي يؤثر على ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم1. يتميز بتكوين شوائب سيتوبلازمية تعرف باسم أجسام ليوي وعصب ليوي في المادة السوداء في الدماغ في منطقة كومباكتا. وقد وجد أن هذه الشوائب السيتوبلازمية تحتوي على مجاميع من البروتين المضطرب جوهريا aSyn2. في PD وغيرها من اعتلالات synucleinopathies ، يتحول aSyn من حالة مضطربة قابلة للذوبان إلى حالة مرضية غير قابلة للذوبان وعالية الهيكلة. في شكله الأصلي ، يعتمد aSyn الأحادي مجموعة واسعة من التكوينات المستقرة من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية طويلة المدى بين التفاعلات N- و C-termini والتفاعلات الكارهة للماء بين منطقة C-terminus ومكون بيتا غير الأميلويد (NAC)3،4،5،6. أي اضطرابات في تلك التفاعلات المستقرة، مثل الطفرات، والتعديلات اللاحقة للترجمة، والتغيرات في البيئة المحلية، يمكن أن تؤدي إلى سوء طي المونومر، وبالتالي إطلاق عملية التجميع7.
في حين أن هناك قدرا هائلا من الأبحاث حول الأشكال قليلة القلة والألياف من aSyn 8,9,10,11 ، هناك حاجة ماسة لدراسة الشكل الأحادي للبروتين وفهم أفضل للمطابقات الوظيفية (وكيف) والتي هي عرضة لتجميع 8,9,10,11 . نظرا لكونه مضطربا في جوهره ، وحجمه 14 كيلوداد فقط ، ويصعب تبلوره ، فإن مونومر aSyn غير قابل لمعظم التقنيات البيولوجية الهيكلية. ومع ذلك ، فإن إحدى التقنيات القادرة على قياس الديناميكيات التوافقية ل aSyn الأحادي هي HDX-MS بالمللي ثانية ، والتي ولدت مؤخرا ملاحظات هيكلية مهمة من شأنها أن تكون صعبة أو مستحيلة الحصول عليها بخلاف ذلك12،13،14. يقيس Millisecond HDX-MS بحساسية متوسط المجموعة التوافقية للبروتين من خلال مراقبة تبادل النظائر في هيدروجين الأميد ، مما يشير إلى إمكانية الوصول إلى المذيبات ومشاركة شبكة الترابط الهيدروجيني لمنطقة بروتين معينة على مقياس زمني بالمللي ثانية. من الضروري التأكيد على جانب المللي ثانية من HDX-MS لأنه ، نظرا لطبيعته المستقرة أصلا ، يعرض aSyn حركية سريعة جدا لتبادل الهيدروجين تظهر أقل بكثير من الحد الأدنى لأنظمة HDX-MS التقليدية. على سبيل المثال ، قام معظم جزيء aSyn باستبدال الهيدروجين بالكامل بالديوتيريوم تحت ظروف داخل الخلايا في أقل من 1 ثانية. وقد قامت عدة مختبرات الآن ببناء أجهزة سريعة الخلط. في هذه الحالة ، يتم استخدام نموذج أولي لأداة تدفق التبريد سريعة الخلط القادرة على أداء HDX-MS مع وقت ميت يبلغ 50 مللي ثانية ودقة زمنية تبلغ 1 مللي ثانية15. في حين أن HDX-MS بالمللي ثانية كان مؤخرا مهما للغاية في دراسة aSyn ، إلا أنه سيكون ذا قيمة في دراسة البروتينات / المناطق المضطربة داخليا على نطاق أوسع وعدد كبير من البروتينات ذات الحلقات / المناطق التي تكون مستقرة بشكل ضعيف فقط. على سبيل المثال ، أدوية الببتيد (على سبيل المثال ، الأنسولين; GLP-1 / الجلوكاجون. tirzepatide) وبروتينات اندماج الببتيد (على سبيل المثال ، مثبط فيروس نقص المناعة البشرية FN3-L35-T1144) هي أشكال دوائية رئيسية حيث يمكن أن تكون المعلومات الهيكلية والمستقرة في مرحلة الحل مدخلا حاسما لقرارات تطوير الأدوية ، ومع ذلك ، فإن الببتيد moiety غالبا ما يكون مستقرا بشكل ضعيف ومستعصيا بواسطة HDX-MS في الثواني الزمنية16،17،18،19،20 . وقد ثبت أن طرق HDX-MS الناشئة مع وضع العلامات في نطاقات الثواني / الدقائق تستمد معلومات هيكلية للحمض النووي G-quadruplexes ، ولكن يجب أن يكون من الممكن توسيع نطاق ذلك ليشمل هياكل قليلة النوكليوتيد الأكثر تنوعا عن طريق تطبيق HDX-MS21 بالمللي ثانية.
يمكن إجراء تجارب HDX-MS على ثلاثة مستويات مختلفة: (1) من أسفل إلى أعلى (حيث يتم هضم البروتين المسمى بشكل بروتيني) ، (2) من الوسط إلى الأسفل (حيث يتم هضم البروتين المسمى بشكل بروتيني ، ويتم تفتيت الببتيدات الناتجة بشكل أكبر بواسطة تقنيات التجزئة الناعمة) ، و (3) من أعلى إلى أسفل (حيث تقوم تقنيات التجزئة الناعمة بتجزئة البروتين المسمى مباشرة)22 . وبالتالي ، فإن بيانات HDX-MS دون الجزيئية تسمح لنا بتوطين سلوك التبادل إلى مناطق محددة من البروتين ، مما يجعل من الأهمية بمكان الحصول على تغطية تسلسل كافية لمثل هذه التجارب. تعتمد الدقة الهيكلية لأي تجربة HDX-MS على عدد الببتيدات المحللة للبروتين أو الشظايا المشتقة من البروتين عند الهضم أو التجزئة الناعمة ، على التوالي. في كل نوع من أنواع التجارب الثلاثة الموضحة أعلاه ، يتم تعيين التغيير في تبادل الأميد في كل ببتيد / جزء مرة أخرى على البنية الأساسية للبروتين للإشارة إلى سلوك المناطق الموضعية من البروتين. في حين يتم تحقيق أعلى دقة هيكلية من خلال التجزئة الناعمة ، فإن وصف هذه التجارب خارج نطاق الدراسة الحالية ، التي تركز على قياس تشكيلات مونومر aSyn. يمكن الحصول على نتائج ممتازة من خلال سير العمل “من أسفل إلى أعلى” المطبق بشكل شائع والموضح هنا.
هنا ، يتم توفير إجراءات حول (1) كيفية إعداد عينات aSyn والمخازن المؤقتة HDX-MS والتعامل معها ، (2) كيفية إجراء رسم خرائط الببتيد لتجربة HDX-MS من أسفل إلى أعلى ، (3) كيفية الحصول على بيانات HDX-MS على aSyn الأحادي في ظل الظروف الفسيولوجية ، وتحديدا في مجال الوقت بالمللي ثانية (باستخدام أداة مصممة خصيصا ؛ كما تم وصف الأدوات البديلة لوضع العلامات بالمللي ثانية) ، و (4) كيفية معالجة وتحليل بيانات HDX-MS. يتم توضيح الطرق التي تستخدم aSyn الأحادي عند درجة الحموضة الفسيولوجية (7.40) في حالتين من ظروف الحل هنا. على الرغم من أنها مفيدة للغاية في دراسة aSyn ، إلا أنه يمكن تطبيق هذه الإجراءات على أي بروتين ولا تقتصر على البروتينات المضطربة في جوهرها.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة ، يتم وصف الإجراءات التالية: (1) إجراء تجارب رسم خرائط الببتيد على aSyn الأحادي للحصول على أعلى تغطية تسلسلية ، (2) الحصول على بيانات HDX-MS بالمللي ثانية على aSyn الأحادي في ظل الظروف الفسيولوجية ، و (3) إجراء تحليل البيانات وتفسير بيانات HDX-MS الناتجة. الإجراءات المقدمة سهلة التنفيذ بش…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل NS من قبل منحة اليوبيل الماسي لمجلس الجامعة. يتم دعم JJP من خلال زمالة UKRI Future Leaders [رقم المنحة: MR/T02223X/1].
Materials
| 1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column | Waters Corporation | 186002346 | Analytical column |
| Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv | VWR | 20060.420 | For LC mobile phases |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | Salt for HDX buffers |
| Chronos | Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) | 667006090 | Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell |
| Deuterium chloride | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-2-50 | For HDX labelling buffers |
| Deuterium oxide (99.9% D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-4 | Deuterated water |
| DynamX 3.0 | Waters Corporation | 176016027 | Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation |
| Enzymate BEH Pepsin Column | Waters Corporation | 186007233 | Pepsin digestion column |
| Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade | Fisher Scientific | 10596814 | For LC mobile phases |
| Guanidinium hydrochloride | Sigma Aldrich | RDD001-500G | Chaotrope/Denaturant |
| HDfleX | University of Exeter | N/A | https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | Salt for HDX buffers |
| LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot | Waters Corporation | 725000637 | Autosampler robot |
| Leucine enkephalin | Waters Corporation | 186006013 | For mass spectrometry lockspray calibration. |
| MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | Software controlling inlet methods and mass spectrometer |
| Maximum recovery vials | Waters Corporation | 600000670CV | 100 pack including caps – used for quench tray in LEAP HDX-2 |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Salt for HDX buffers |
| Millipore 0.22 µm syringe filters | Millipore | N9CA7069B | Syringe filters |
| ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | Salt for HDX buffers |
| Peltier temperature controller | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot. |
| ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors. |
| Reagent pot caps | Waters Corporation | 186004632 | 100 pack |
| Reagent pots for LEAP HDX-2 | Waters Corporation | 186001420 | 100 pack excluding caps – used for buffers in LEAP HDX-2 |
| Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-57 | For HDX labelling buffers |
| Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) | Amicon (Merck Sigma Aldrich) | UFC5003 | Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments. |
| Synapt G2-Si mass spectrometer | Waters Corporation | 176850035 | Mass spectrometer |
| Total recovery vials | Waters Corporation | 600000671CV | 100 pack including caps – used for labelling tray in LEAP HDX-2 |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253-250G | Buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | Buffer |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378-1KG | Chaotrope/Denaturant |
| VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column | Waters Corporation | 186004623 | Trap desalting column |
References
- Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson’s disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
- Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N. α-Synuclein misfolding and Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): Molecular Basis of Disease. 1822 (2), 261-285 (2012).
- Dedmon, M. M., Lindorff-Larsen, K., Christodoulou, J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Mapping long-range interactions in α-synuclein using spin-label NMR and ensemble molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 476-477 (2005).
- Esteban-Martín, S., Silvestre-Ryan, J., Bertoncini, C. W., Salvatella, X. Identification of fibril-like tertiary contacts in soluble monomeric α-synuclein. Biophysical Journal. 105 (5), 1192-1198 (2013).
- McClendon, S., Rospigliosi, C. C., Eliezer, D. Charge neutralization and collapse of the C-terminal tail of alpha-synuclein at low pH. Protein Science. 18 (7), 1531-1540 (2009).
- Ranjan, P., Kumar, A. Perturbation in long-range contacts modulates the kinetics of amyloid formation in α-synuclein familial mutants. ACS Chemical Neuroscience. 8 (10), 2235-2246 (2017).
- Villar-Piqué, A., da Fonseca, T. L., Outeiro, T. F. Structure, function and toxicity of alpha-synuclein: the Bermuda triangle in synucleinopathies. Journal of Neurochemistry. 139, 240-255 (2015).
- Seetaloo, N., Zacharopoulou, M., Stephens, A. D., Schierle, G. S. K., Phillips, J. J. Local structural dynamics of alpha-synuclein correlate with aggregation in different physiological conditions. bioRxiv. , (2022).
- Stephens, A. D., et al. Extent of N-terminus exposure of monomeric alpha-synuclein determines its aggregation propensity. Nature Communications. 11 (1), 2820 (2020).
- Stephens, A. D., et al. Different structural conformers of monomeric α-synuclein identified after lyophilizing and freezing. Analytical Chemistry. 90 (11), 6975-6983 (2018).
- Lautenschläger, J., et al. C-terminal calcium binding of α-synuclein modulates synaptic vesicle interaction. Nature Communications. 9 (1), 712 (2018).
- Oganesyan, I., Lento, C., Tandon, A., Wilson, D. J. Conformational dynamics of α-synuclein during the interaction with phospholipid nanodiscs by millisecond hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (5), 1169-1179 (2021).
- Keppel, T. R., Weis, D. D. Analysis of disordered proteins using a simple apparatus for millisecond quench-flow H/D exchange. Analytical Chemistry. 85 (10), 5161-5168 (2013).
- Al-Naqshabandi, M. A., Weis, D. D. Quantifying protection in disordered proteins using millisecond hydrogen exchange-mass spectrometry and peptic reference peptides. 생화학. 56 (31), 4064-4072 (2017).
- Kish, M., et al. Allosteric regulation of glycogen phosphorylase solution phase structural dynamics at high spatial resolution. bioRxiv. , (2019).
- El-Amine, M., et al. Mechanisms of tolerance induction by a gene-transferred peptide-IgG fusion protein expressed in B lineage cells. Journal of Immunology. 165 (10), 5631-5636 (2000).
- Kishimoto, S., et al. Site-specific chemical conjugation of antibodies by using affinity peptide for the development of therapeutic antibody format. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 698-702 (2019).
- Xu, W., et al. A protein-based, long-acting HIV-1 fusion inhibitor with an improved pharmacokinetic profile. Pharmaceuticals. 15 (4), 424 (2022).
- Frías, J. P., et al. Tirzepatide versus semaglutide once weekly in patients with type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (6), 503-515 (2021).
- Gerstein, H. C., et al. Cardiovascular and renal outcomes with efpeglenatide in type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (10), 896-907 (2021).
- Largy, E., Gabelica, V. Native hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry of structured DNA oligonucleotides. Analytical Chemistry. 92 (6), 4402-4410 (2020).
- Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: What is it and what can it tell us. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 967-972 (2010).
- Glasoe, P. K., Long, F. A. Use of glass electrodes to measure acidities in deuterium oxide. Journal of Physical Chemistry. 64 (1), 188-190 (1960).
- Krȩzel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
- Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., Popp, J. The Bouguer-Beer-Lambert law: Shining light on the obscure. ChemPhysChem. 21 (18), 2029-2046 (2020).
- Gasteiger, E., et al. . The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Bateman, R. H., et al. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 13 (7), 792-803 (2002).
- Sørensen, L., Salbo, R. Optimized workflow for selecting peptides for HDX-MS data analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (11), 2278-2281 (2018).
- Demmers, J. A. A., Rijkers, D. T. S., Haverkamp, J., Killian, J. A., Heck, A. J. R. Factors affecting gas-phase deuterium scrambling in peptide ions and their implications for protein structure determination. Journal of the American Chemical Society. 124 (37), 11191-11198 (2002).
- Seetaloo, N., Kish, M., Phillips, J. J. HDfleX: Software for flexible high structural resolution of hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry data. Analytical Chemistry. 94 (11), 4557-4564 (2022).
- Hageman, T. S., Weis, D. D. Reliable identification of significant differences in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements using a hybrid significance testing approach. Analytical Chemistry. 91 (13), 8008-8016 (2019).
- Hageman, T. S., Weis, D. D. A structural variant approach for establishing a detection limit in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements. Analytical Chemistry. 91 (13), 8017-8024 (2019).
- Chetty, P. S., et al. Helical structure and stability in human apolipoprotein A-I by hydrogen exchange and mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19005-19010 (2009).
- Keppel, T. R., Weis, D. D. Mapping residual structure in intrinsically disordered proteins at residue resolution using millisecond hydrogen/deuterium exchange and residue averaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 547-554 (2015).
- Li, J., Rodnin, M. V., Ladokhin, A. S., Gross, M. L. Hydrogen-deuterium exchange and mass spectrometry reveal the pH-dependent conformational changes of diphtheria toxin T domain. 생화학. 53 (43), 6849-6856 (2014).
- Roder, H., Elöve, G. A., Englander, S. W. Structural characterization of folding intermediates in cytochrome c by H-exchange labelling and proton NMR. Nature. 335 (6192), 700-704 (1988).
- Rob, T., et al. Measuring dynamics in weakly structured regions of proteins using microfluidics-enabled subsecond H/D exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (8), 3771-3779 (2012).
- Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13 (13), 2528-2532 (2013).
- Svejdal, R. R., Dickinson, E. R., Sticker, D., Kutter, J. P., Rand, K. D. Thiol-ene microfluidic chip for performing hydrogen/deuterium exchange of proteins at subsecond time scales. Analytical Chemistry. 91 (2), 1309-1317 (2018).
- Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
- Coales, S. J., E, S. Y., Lee, J. E., Ma, A., Morrow, J. A., Hamuro, Y. Expansion of time window for mass spectrometric measurement of amide hydrogen/deuterium exchange reactions. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (24), 3585-3592 (2010).
- Hoyer, W., et al. Dependence of alpha-synuclein aggregate morphology on solution conditions. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 383-393 (2002).
- Rand, K. D., Pringle, S. D., Morris, M., Engen, J. R., Brown, J. M. ETD in a traveling wave ion guide at tuned Z-spray ion source conditions allows for site-specific hydrogen/deuterium exchange measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22 (10), 1784-1793 (2011).
- Kan, Z. Y., Ye, X., Skinner, J. J., Mayne, L., Englander, S. W. ExMS2: An integrated solution for hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry data analysis. Analytical Chemistry. 91 (11), 7474-7481 (2019).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Characterizing short-lived protein folding intermediates by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (20), 8591-8597 (2010).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
- Mistarz, U. H., et al. Photodissociation mass spectrometry accurately localizes sites of backbone deuteration in peptides. Analytical Chemistry. 90 (2), 1077-1080 (2017).
- Phillips, J. J., et al. Rate of asparagine deamidation in a monoclonal antibody correlating with hydrogen exchange rate at adjacent downstream residues. Analytical Chemistry. 89 (4), 2361-2368 (2017).
