Структурный ансамбль мономерного альфа-синуклеина влияет на его физиологическую функцию и физико-химические свойства. Настоящий протокол описывает, как выполнить миллисекундную масс-спектрометрию водорода/дейтерия-обмена и последующий анализ данных для определения конформационной информации о мономере этого внутренне неупорядоченного белка в физиологических условиях.
Альфа-синуклеин (aSyn) является внутренне неупорядоченным белком, фибриллярные агрегаты которого в изобилии присутствуют в тельцах Леви и нейритах, которые являются отличительными признаками болезни Паркинсона. Тем не менее, большая часть его биологической активности, а также его агрегация, централизованно включает растворимую мономерную форму белка. Выяснение молекулярных механизмов биологии и патофизиологии aSyn требует структурно высокоразрешенных методов и чувствительно к биологическим условиям. Его изначально развернутые, метастабильные структуры делают мономерный aSyn трудноразрешимым для многих методов структурной биологии. Здесь описано применение одного из таких подходов: водородно-дейтерий-обменной масс-спектрометрии (HDX-MS) на миллисекундной шкале времени для изучения белков с низкой термодинамической стабильностью и слабыми факторами защиты, такими как aSyn. В миллисекундной шкале времени данные HDX-MS содержат информацию о доступности растворителя и водородно-связанной структуре aSyn, которые теряются при более длительном времени маркировки, в конечном итоге давая структурное разрешение до уровня аминокислот. Таким образом, HDX-MS может предоставлять информацию с высоким структурным и временным разрешением о конформационной динамике и термодинамике, внутри- и межмолекулярных взаимодействиях, а также структурном влиянии мутаций или изменений на условия окружающей среды. Несмотря на широкое применение, показано, как получать, анализировать и интерпретировать миллисекундные измерения HDX-MS в мономерном aSyn.
Болезнь Паркинсона (БП) является нейродегенеративным заболеванием, поражающим миллионы людей во всем мире1. Он характеризуется образованием цитоплазматических включений, известных как тельца Леви и нейриты Леви в области черной субстанции мозга. Было обнаружено, что эти цитоплазматические включения содержат агрегаты внутренне неупорядоченного белка aSyn2. При БП и других синуклеинопатиях aSyn превращается из растворимого неупорядоченного состояния в нерастворимое, высокоструктурированное болезненное состояние. В своей родной форме мономерный aSyn принимает широкий спектр конформаций, стабилизированных дальнодействующими электростатическими взаимодействиями между его N- и C-концами и гидрофобными взаимодействиями между его C-концом и областью неамилоидного бета-компонента (NAC) 3,4,5,6. Любые нарушения в этих стабилизирующих взаимодействиях, такие как мутации, посттрансляционные модификации и изменения в локальной среде, могут привести к неправильному сворачиванию мономера, тем самым запуская процесс агрегации7.
В то время как существует огромное количество исследований олигомерной и фибриллярной форм aSyn 8,9,10,11, существует острая необходимость изучить мономерную форму белка и лучше понять, какие конформеры функциональны (и как), а какие склонны к агрегированию 8,9,10,11 . Будучи внутренне неупорядоченным, всего 14 кДа в размере и трудно кристаллизующимся, мономер aSyn не поддается большинству структурных биологических методов. Однако одним из методов, способных измерить конформационную динамику мономерного aSyn, является миллисекундный HDX-MS, который недавно породил важные структурные наблюдения, которые было бы сложно или невозможно получить в противном случае 12,13,14. Миллисекундный HDX-MS чувствительно измеряет среднее значение конформационного ансамбля белка путем мониторинга изотопного обмена на амидных водородах, что указывает на доступность растворителей и участие в сети водородных связей определенной области белка на миллисекундной шкале времени. Необходимо подчеркнуть миллисекундный аспект HDX-MS, поскольку из-за его изначально развернутой, метастабильной природы aSyn демонстрирует очень быструю кинетику водородообмена, которая проявляется значительно ниже нижнего предела обычных систем HDX-MS. Например, большая часть молекулы aSyn полностью обменяла водород на дейтерий во внутриклеточных условиях менее чем за 1 с. В настоящее время несколько лабораторий создали приборы для быстрого смешивания; В этом случае используется прототип быстромиссирующего гасящего прибора, способного выполнять HDX-MS с мертвым временем 50 мс и временным разрешением 1 мс15. В то время как миллисекундный HDX-MS в последнее время имеет острое значение в изучении aSyn, он представляет собой ценность для изучения внутренне неупорядоченных белков / областей более широко и большого количества белков с петлями / областями, которые только слабо стабильны. Например, пептидные препараты (например, инсулин; GLP-1/глюкагон; tirzepatide) и белки пептидного слияния (например, ингибитор ВИЧ FN3-L35-T1144) являются основными форматами лекарств, где информация о структуре и стабильности фазы раствора может быть критическим фактором для принятия решений о разработке лекарств, и, тем не менее, пептидный фрагмент часто только слабо стабилен и трудноизлечим HDX-MS в секундной шкалевремени 16,17,18,19,20 . Было показано, что эмерджентные методы HDX-MS с маркировкой в секундах/минутах доменов получают структурную информацию для G-квадруплексов ДНК, но должно быть возможно распространить ее на более разнообразные олигонуклеотидные структуры путем применения миллисекунд hdX-MS21.
Эксперименты HDX-MS могут быть выполнены на трех различных уровнях: (1) снизу вверх (при этом меченый белок переваривается протеолитически), (2) средний-нижний (при этом меченый белок переваривается протеолитически, а полученные пептиды фрагментируются далее методами мягкой фрагментации) и (3) сверху вниз (при этом методы мягкой фрагментации непосредственно фрагментируют меченый белок)22 . Таким образом, субмолекулярные данные HDX-MS позволяют локализовать обменное поведение в определенных областях белка, что делает критически важным наличие адекватного охвата последовательностей для таких экспериментов. Структурное разрешение любого эксперимента HDX-MS зависит от количества протеолитических пептидов или фрагментов, полученных из белка при переваривании или мягкой фрагментации, соответственно. В каждом из трех типов экспериментов, описанных выше, изменение амидного обмена на каждом пептиде / фрагменте отображается обратно на первичную структуру белка, чтобы указать на поведение локализованных областей белка. В то время как самое высокое структурное разрешение достигается за счет мягкой фрагментации, описание этих экспериментов выходит за рамки текущего исследования, которое фокусируется на измерении конформаций мономеров aSyn. Отличные результаты могут быть получены с помощью широко применяемого рабочего процесса «снизу вверх», описанного здесь.
Здесь представлены процедуры по следующим вопросам: (1) как подготовить и обработать образцы aSyn и буферы HDX-MS, (2) как выполнить отображение пептидов для эксперимента HDX-MS снизу вверх, (3) как получить данные HDX-MS о мономерном aSyn в физиологических условиях, особенно в миллисекундной временной области (с использованием специально разработанного инструмента; также были описаны альтернативные инструменты для миллисекундной маркировки), и (4) как обрабатывать и анализировать данные HDX-MS. Здесь приведены примеры методов, использующих мономерный aSyn при физиологическом рН (7,40) в двух условиях раствора. Хотя эти процедуры критически полезны при изучении aSyn, они могут быть применены к любому белку и не ограничиваются внутренне неупорядоченными белками.
В настоящей статье описаны следующие процедуры: (1) проведение экспериментов по пептидному картированию на мономерном aSyn для получения наивысшего охвата последовательностей, (2) получение миллисекундных данных HDX-MS на мономерном aSyn в физиологических условиях и (3) выполнение анализа дан…
The authors have nothing to disclose.
NS финансируется Бриллиантовой юбилейной стипендией Совета университета. JJP поддерживается стипендией UKRI Future Leaders Fellowship [Номер гранта: MR/T02223X/1].
1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column | Waters Corporation | 186002346 | Analytical column |
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv | VWR | 20060.420 | For LC mobile phases |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | Salt for HDX buffers |
Chronos | Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) | 667006090 | Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell |
Deuterium chloride | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-2-50 | For HDX labelling buffers |
Deuterium oxide (99.9% D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-4 | Deuterated water |
DynamX 3.0 | Waters Corporation | 176016027 | Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation |
Enzymate BEH Pepsin Column | Waters Corporation | 186007233 | Pepsin digestion column |
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade | Fisher Scientific | 10596814 | For LC mobile phases |
Guanidinium hydrochloride | Sigma Aldrich | RDD001-500G | Chaotrope/Denaturant |
HDfleX | University of Exeter | N/A | https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 |
KCl | Sigma Aldrich | P3911 | Salt for HDX buffers |
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot | Waters Corporation | 725000637 | Autosampler robot |
Leucine enkephalin | Waters Corporation | 186006013 | For mass spectrometry lockspray calibration. |
MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | Software controlling inlet methods and mass spectrometer |
Maximum recovery vials | Waters Corporation | 600000670CV | 100 pack including caps – used for quench tray in LEAP HDX-2 |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Salt for HDX buffers |
Millipore 0.22 µm syringe filters | Millipore | N9CA7069B | Syringe filters |
ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument |
NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | Salt for HDX buffers |
Peltier temperature controller | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot. |
ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors. |
Reagent pot caps | Waters Corporation | 186004632 | 100 pack |
Reagent pots for LEAP HDX-2 | Waters Corporation | 186001420 | 100 pack excluding caps – used for buffers in LEAP HDX-2 |
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-57 | For HDX labelling buffers |
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) | Amicon (Merck Sigma Aldrich) | UFC5003 | Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments. |
Synapt G2-Si mass spectrometer | Waters Corporation | 176850035 | Mass spectrometer |
Total recovery vials | Waters Corporation | 600000671CV | 100 pack including caps – used for labelling tray in LEAP HDX-2 |
Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253-250G | Buffer |
Trizma base | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | Buffer |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-1KG | Chaotrope/Denaturant |
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column | Waters Corporation | 186004623 | Trap desalting column |