O presente protocolo descreve uma técnica única chamada treinamento resistido ajustado à dosagem (DART), que pode ser incorporada em estudos de reabilitação de precisão realizados em pequenos animais, como camundongos.
O treinamento resistido progressivo (PRT), que envolve a realização de contrações musculares contra cargas externas progressivamente maiores, pode aumentar a massa muscular e a força em indivíduos saudáveis e em populações de pacientes. Há necessidade de ferramentas de reabilitação de precisão para testar a segurança e a eficácia do PRT para manter e/ou restaurar a massa muscular e a força em estudos pré-clínicos em modelos animais pequenos e grandes. A metodologia PRT e o dispositivo descritos neste artigo podem ser usados para realizar treinamento de resistência ajustado à dosagem (DART). O dispositivo DART pode ser usado como um dinamômetro autônomo para avaliar objetivamente o torque contrátil concêntrico gerado pelos dorsiflexores do tornozelo em camundongos ou pode ser adicionado a um sistema de dinamometria isocinética pré-existente. O dispositivo DART pode ser fabricado com uma impressora 3D padrão com base nas instruções e arquivos de impressão 3D de código aberto fornecidos neste trabalho. O artigo também descreve o fluxo de trabalho para um estudo para comparar o dano muscular induzido pela contração causado por um único ataque de DART com o dano muscular causado por um surto comparável de contrações isométricas (ISOM) em um modelo de camundongo de distrofia muscular da cintura dos membros tipo 2B / R2 (camundongos BLAT). Os dados de oito camundongos BLAJ (quatro animais para cada condição) sugerem que menos de 10% do músculo tibial anterior (AT) foi danificado por um único ataque de DART ou ISOM, com o DART sendo menos prejudicial que o ISOM.
O exercício confere inúmeros benefícios para a saúde do músculo esquelético (revisado em Vina et al.1). Especificamente, o treinamento de resistência progressiva (PRT), que envolve a realização de contrações musculares contra cargas externas progressivamente maiores (por exemplo, barras, halteres, circuitos cabo-polia-peso), é conhecido por ajudar a aumentar a massa muscular e a força em indivíduos saudáveis e populações de pacientes (revisado em publicações anteriores 2,3 ). O PRT baseia-se no princípio da sobrecarga, que afirma que, quando o músculo se contrai contra cargas externas progressivamente maiores, ele se adapta aumentando sua área transversal fisiológica, bem como a capacidade de produção de força4. Os modelos existentes de PRT em roedores incluem escalada de escada com resistência aplicada à cauda, cocontração dos músculos agonistas contra a resistência dos antagonistas, corrida com um arnês pesado, um exercício de agachamento provocado por um choque elétrico e corrida de roda resistida 5,6,7,8,9,10 (revisada em publicações anteriores 11,12 ). No entanto, atualmente não existem ferramentas de pesquisa para realizar com precisão o PRT direcionado ao músculo e ajustado à dosagem em camundongos que se assemelhem aos métodos e dispositivos de PRT usados na pesquisa e prática clínica humana12,13. Isso limita a capacidade dos investigadores de estudar a segurança e a eficácia do PRT dosado com precisão em estudos básicos e pré-clínicos em camundongos.
Para superar essa barreira, uma metodologia e um dispositivo PRT são desenvolvidos neste estudo com base nos projetos de circuitos cabo-polia-peso empregados em equipamentos de treinamento resistido em ginásios modernos14,15,16. Este método de PRT é referido como treinamento de resistência ajustado à dosagem (DART), e o dispositivo é chamado de dispositivo DART. Além de sua funcionalidade como ferramenta de treinamento de reabilitação de precisão, o dispositivo DART também pode ser usado como um instrumento autônomo para avaliar objetivamente o torque contrátil concêntrico máximo que pode ser gerado pelo músculo tibial anterior (AT) em um rato, semelhante à forma como o máximo de uma repetição (1RM, a carga máxima que pode ser levantada com sucesso / movida / pressionada / agachada apenas uma vez, mantendo a boa forma) é avaliada em humanos17, 18. O dispositivo DART também pode ser acoplado a um dinamômetro isocinético personalizado ou comercial para medir o pico de força tetânica isométrica produzida pelo músculo TA em um camundongo (comparável à contração voluntária máxima [MVC] em humanos) e, em seguida, executar o PRT ajustado pela dosagem com uma resistência baseada no pico de força tetânica (por exemplo, 50% da força de pico).
Este artigo descreve a construção do dispositivo DART e explica como ele pode ser acoplado a um dinamômetro personalizado, que já foi descrito em publicações anteriores 19,20,21,22, para avaliar o torque contrátil e realizar o DART. O estudo também descreve como o dispositivo DART foi usado para comparar o dano muscular induzido pelo exercício causado por um único ataque de DART (4 séries de 10 contrações concentricamente tendenciosas com 50% de 1RM) com danos causados por um surto comparável de contrações isométricas (4 conjuntos de 10 contrações isométricas) em um modelo de camundongo de distrofia muscular tipo 2B da cintura do membro (LGMD2B, ou LGMDR2)23,24. O modelo de camundongo que foi estudado carece de uma proteína chamada disferina, que desempenha um papel importante na proteção do músculo esquelético contra danos musculares de início tardio após contrações excêntricas prejudiciais 22,25,26,27,28,29,30 . Também foi demonstrado em camundongos machos deficientes em disferlina que o exercício forçado concentricamente tendencioso não é tão prejudicial quanto o exercício forçado excentricamente tendencioso e que a exposição prévia ao treinamento concentricamente tendencioso oferece proteção contra lesões de um surto subsequente de contrações excentricamente tendenciosas22. Uma vez que o presente estudo foi realizado para testar a viabilidade da presente metodologia e dispositivo DART na realização de treinamento de resistência concentricamente tendencioso e ajustado à dosagem, camundongos machos deficientes em disferlina foram escolhidos para a investigação para comparar novos dados do dispositivo DART com dados anteriores. Em estudos futuros, camundongos fêmeas BLAJ serão incluídos para estudar o efeito do sexo como variável biológica em relação à resposta ao DART. Camundongos com idade ~1,5 anos foram estudados, uma vez que já apresentam alterações distróficas em muitos grupos musculares e, portanto, modelam o estado fisiopatológico em que os músculos podem estar em pacientes que já apresentam fraqueza e perda muscular e estão buscando cuidados de reabilitação para manter a massa e a força muscular26.
Este artigo apresenta instruções passo a passo sobre como construir um dispositivo para realizar um tipo de treinamento de reabilitação de precisão chamado treinamento de resistência ajustado à dosagem (DART). O trabalho também descreve a aplicação do dispositivo DART e metodologia em um estudo de treinamento para comparar o dano muscular 3 dias após uma única sessão de DART (grupo DART) com o dano 3 dias após um ataque comparável de treinamento isométrico (grupo ISOM).
As etap…
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi financiado por doações da Jain Foundation Inc., R03HD091648 do NICHD, uma Bolsa Piloto da AR3T sob NIH P2CHD086843, um Prêmio FRAP da EACPHS da Wayne State University, um Pacote de Inicialização da Faculdade da Wayne State University e um subcontrato de 1R01AR079884-01 (Peter L. Jones PI) para a JAR. Este estudo também foi financiado por uma bolsa de pesquisa da American Physical Therapy Association – Michigan (APTA-MI) para JMB, MEP e JAR. Os autores reconhecem a Dra. Renuka Roche (Professora Associada, Eastern Michigan University, MI) por ler criticamente o manuscrito e fornecer feedback. Os autores agradecem ao Sr. Anselm D. Motha por conselhos sobre impressão 3D. Os autores agradecem aos pacientes com disferlinopatias que compartilharam suas histórias no site da Fundação Jain em https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories, particularmente suas experiências com o exercício.
AnMiao Star 608 Ceramic Ball Bearing | Anmiao Star (N/A) | AMS127 | High precision, low friction wheel bearing. If make and model is not commercially available, an alternative version of a 608 low-friction wheel bearing, 8 mm bore diameter, 22 mm outside diameter, with silicon nitride ceramic balls in 420 stainless steel housing should suffice. Excess friction in the wheel bearing will adversely impact performance of the DART device and will increase overall resistance to muscle contractions. |
Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
B6.A-Dysfprmd/GeneJ (a.k.a. BLAJ mice) | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Special colony maintained by The Jain Foundation Inc. for collaborators who study dysferlin. | Stock #012767 | Dysferlin deficient mice that model human limb girdle muscular dystrophy type 2B/R2. |
Bipolar, transcutaneous, neuromuscular electrical stimulation (NMES) electrode | Harvard Apparatus, Holliston, MA | BS4 50–6824 | Electrode for NMES. If this electrode is not commercially available, please contact corresponding author for alternatives. |
Coplin Staining Dish | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog No. S17495 | Staining dish/jar for hematoxylin and eosin (H&E) staining of sections |
Cura 4.4.1. Software | Ultimaker, Utrecht, Netherlands | Ultimaker Cura 4.4.1. | Slicing software to convert stereolithography files into G-CODE files |
Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
Eosin Y | Millipore Sigma (Burlington, MA) | HT110132-1L | Pink cytoplasmic stain |
Gorilla Super Glue | The Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH) | Gorilla Super Glue Micro Precise | Cyanoacrylate adhesive to bond PLA components |
Hematoxylin solution, Gill No.3 | Millipore Sigma (Burlington, MA) | GHS332-1L | Dark blue stain for nuclei |
HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
Lab Wipes. Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog No. 06-666. Manufacturer #34120 | Laboratory wipes to blot mineral oil from muscle tissue before snap freezing and for other purposes. |
Labview 2014 | National Instruments, Austin, Texas, USA | Labview 2014 | Software for custom-written programs/routines that operate the dynamometer and trigger the NMES stimulator. |
Liquid nitrogen HDPE Dewar Flasks | ThermoFisher (Waltham, MA) | S34074B. Thermo Scientific 41502000/EMD | Flask to hold liquid nitrogen for snap freezing muscle or other tissue |
Magic depilatory cream | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
Metal alligator clip | JINSHANGTOPK (web-based business) | 24Pcs 51mm Metal Alligator Clip Spring Clamps | Spring clamp to hold tibial pin |
Micrscope slides | Globe Scientific (Mahwah, NJ) | 1354W. Diamond White Glass Slides | Charged microscope slides |
Mineral Oil | ThermoFisher (Waltham, MA) | BP26291 | Mineral oil to cryoprotect muscle tissue before snap freezing |
Monoprice Premium 3D Printer Filament PLA | Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) | #11778 | Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spool, Gray. This is the material used to 3D print device components. |
Monoprice Select Mini V2 3D printer | Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) | Mini V2 3D | 3D printer for computer-aided fabrication of device components. |
NIH Image software | National Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD) | NIH Image for Windows | Image processing and analysis software used to quantify area of muscle damage. NIH Image is also known as Image J. |
Photoshop CS4 | Adobe (San Jose, CA) | Creative Suite (CS4). 64 bit version for Windows | Image processing and analysis software used to generate tiled/stiched images of entire muscle cross-section from images of indvidual overlapping fields |
PSIU6 stimulation isolation unit | Grass Instruments (West Warwick, RI) | PSIU6 isolation unit | Isolation unit for NMES. Stimulators, such as Model 4100 from A-M come with a built in stimulation isoloation unit |
Roboz 4-0 silk black braided suture material | Roboz Surgical (Gaithersburg, MD) | Roboz Surgical SUT152 | Suture material to connect DART device footplate to dynamometer footplate or resistance for resistance training |
S48 square pulse stimulator | Grass Instruments (West Warwick, RI) | S48 Stimulator | Laboratory electrical stimulator for NMES . If this stimulator is not commercially available, Model 4100 Isolated High Power Stimulator from A-M systems could be an alternative. Please contact co-author Jones for more information. |
Scott’s bluing reagent | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | 6697-32 | Bluing solution that intensifies hematoxylin nuclear staining |
SigmaStat version 3.5 | Systat Software (San Jose, CA) | SigmaStat version 3.5 | Statistical software package for statistical analyses |
Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled tabletop anesthesia system |
Triple antibiotic first aid ointment | Global Health Products (wed-based business) | Globe Triple Antibiotic First Aid Ointment, 1 oz (2-Pack) First Aid Antibiotic Ointment | Antibiotic ointment applied on tibial pin as part of post-procedural care |