Summary

Faire progresser l’imagerie haute résolution des assemblages de virus dans le liquide et la glace

Published: July 20, 2022
doi:

Summary

Ici, des protocoles sont décrits pour préparer des assemblages de virus adaptés à l’analyse liquide-EM et cryo-EM à l’échelle nanométrique en utilisant la microscopie électronique à transmission.

Abstract

L’intérêt pour la microscopie électronique liquide (EM liquide) a explosé ces dernières années, car les scientifiques peuvent maintenant observer des processus en temps réel à l’échelle nanométrique. Il est extrêmement souhaitable de coupler des informations cryo-EM à haute résolution avec des observations dynamiques, car de nombreux événements se produisent à des échelles de temps rapides – de l’ordre de la milliseconde ou plus. Une meilleure connaissance des structures flexibles peut également aider à la conception de nouveaux réactifs pour lutter contre les agents pathogènes émergents, tels que le SRAS-CoV-2. Plus important encore, l’observation des matériaux biologiques dans un environnement fluide donne un aperçu unique de leur performance dans le corps humain. Les méthodes nouvellement développées ici sont présentées pour étudier les propriétés à l’échelle nanométrique des assemblages de virus dans la glace liquide et vitreuse. Pour atteindre cet objectif, des échantillons bien définis ont été utilisés comme systèmes modèles. Des comparaisons côte à côte des méthodes de préparation des échantillons et des informations structurelles représentatives sont présentées. Les caractéristiques sub-nanométriques sont montrées pour les structures résolues dans la plage de ~3,5-Å-10 Å. Parmi les autres résultats récents qui soutiennent ce cadre complémentaire, citons les connaissances dynamiques des candidats vaccins et des thérapies à base d’anticorps imagées dans un liquide. Dans l’ensemble, ces applications corrélatives font progresser notre capacité à visualiser la dynamique moléculaire, fournissant un contexte unique pour leur utilisation dans la santé et la maladie humaines.

Introduction

La recherche biomédicale améliore notre compréhension de la santé et des maladies humaines grâce au développement de nouvelles technologies. L’imagerie à haute résolution transforme notre vision du nanomonde – nous permettant d’étudier les cellules et les molécules dans les moindres détails 1,2,3,4,5. L’information statique des composants dynamiques tels que les polymères mous, les assemblages de protéines ou les virus humains ne révèle qu’un instantané limité de leur récit complexe. Pour mieux comprendre le fonctionnement des entités moléculaires, leur structure et leur fonction doivent être étudiées conjointement.

Les progrès récents dans la production de matériaux tels que le graphène atomiquement mince ou les micropuces à base de silicium offrent de nouvelles possibilités d’analyse structure-fonction en temps réel à l’aide de microscopes électroniques à transmission (MET). Ces matériaux peuvent créer des chambres hermétiquement scellées pour l’imagerie EM en direct 6,7,8,9,10,11. Le nouveau champ de liquide-EM, le corrélat à température ambiante à cryo-EM, fournit des vues sans précédent des matériaux durs ou mous en solution, permettant aux scientifiques d’étudier simultanément la structure et la dynamique de leur échantillon. Les applications EM liquides comprennent des enregistrements en temps réel de nanoparticules thérapeutiques interagissant avec les cellules souches cancéreuses ainsi que des changements dans les subtilités moléculaires des pathogènes viraux12,13,14.

Tout comme les progrès méthodologiques ont stimulé la révolution de la résolution dans le domaine de la cryo-EM, de nouvelles techniques et méthodes sont nécessaires pour étendre l’utilisation de la ME liquide en tant qu’outil à haut débit pour la communauté scientifique. L’objectif global des méthodes présentées ici est de rationaliser les protocoles de préparation des échantillons liquides. La raison d’être des techniques développées est d’utiliser de nouvelles conceptions de micropuces et de dispositifs de chargement automatique, adaptés à la collecte de données liquides et cryo-EM (Figure 1)7,14,15,16,17. Les assemblages sont scellés mécaniquement à l’aide de clips de grille standard pour les instruments automatisés, tels que le Krios, qui peut accueillir plusieurs échantillons par session ou un TEM F200C (Figure 2). Cette méthodologie étend l’utilisation de l’imagerie haute résolution au-delà des applications cryo-EM standard, démontrant des objectifs plus larges pour l’analyse des matériaux en temps réel.

Dans le présent article vidéo, des protocoles sont présentés pour la préparation d’assemblages de virus dans un liquide avec et sans porte-échantillons disponibles dans le commerce. En utilisant le porte-échantillon spécialisé pour les échantillons liquides-EM, les échantillons liquides minces peuvent fournir des informations structurelles comparables aux échantillons cryo-EM, ainsi que des informations dynamiques sur les échantillons. Des méthodes de préparation d’échantillons liquides à l’aide d’outils de chargement automatique pour les routines à haut débit ont également été démontrées. Le principal avantage par rapport aux autres techniques est que la production automatisée d’échantillons permet à l’utilisateur d’évaluer rapidement ses échantillons pour une épaisseur et un dosage d’électrons optimaux avant la collecte des données. Cette technique de criblage identifie rapidement les zones idéales pour les enregistrements en temps réel dans un liquide ou de la glace12,14,18,19. Aux fins de la détermination de la structure 3D, la solution EM liquide peut compléter les méthodes cryo-EM établies de longue date mises en œuvre dans la cryo-EM. Les lecteurs utilisant des technologies conventionnelles de GDT ou de cryo-EM peuvent envisager d’utiliser des flux de travail liquide-EM pour fournir de nouvelles observations dynamiques de leurs échantillons d’une manière qui complète leurs stratégies actuelles.

Les échantillons de virus utilisés dans ce protocole comprennent le virus adéno-associé purifié de sous-type 3 (AAV) obtenu en cadeau et cultivé dans des conditions standard12. Des assemblages sous-viraux non infectieux du SRAS-CoV-2 dérivés du sérum de patients atteints de COVID-1912 et obtenus d’une source commerciale ont également été utilisés. Enfin, des particules à double couche (DLP) purifiées du rotavirus simien (souche SA11) ont été obtenues dans le laboratoire du Dr Sarah M. McDonald Esstman à l’Université de Wake Forest et cultivées en utilisant des conditions standard 6,17. Les progiciels décrits ici sont disponibles gratuitement et les liens ont été fournis dans la section Tableau des matériaux.

Protocol

1. Chargement du porte-échantillon pour liquide-EM Nettoyez les micropuces de nitrure de silicium (SiN) en incubant chaque puce dans 150 mL d’acétone pendant 2 minutes, suivie d’une incubation dans 150 mL de méthanol pendant 2 min. Laissez les copeaux sécher dans un flux d’air laminaire. Nettoyez au plasma les copeaux séchés à l’aide d’un instrument à décharge luminescente fonctionnant dans des conditions standard de 30 W, 15 mA pendant 45 s en utilisant du gaz argo…

Representative Results

Un TEM liquide fonctionnant à 200 kV a été utilisé pour toutes les expériences d’imagerie EM liquide et un cryo-TEM fonctionnant à 300 kV a été utilisé pour toute la collecte de données cryo-EM. Des images et des structures représentatives de plusieurs virus sont présentées pour démontrer l’utilité des méthodes sur divers sujets de test. Il s’agit notamment du virus adéno-associé recombinant de sous-type 3 (AAV), des assemblages sous-viraux du SARS-CoV-2 dérivés du sérum du patient et des parti…

Discussion

De nouvelles opportunités sont présentées pour rationaliser les flux de travail actuels de liquide EM en utilisant de nouveaux outils automatisés et des technologies adaptées du domaine cryo-EM. Les applications impliquant la nouvelle technique sandwich par micropuce sont importantes par rapport à d’autres méthodes, car elles permettent une analyse d’imagerie à haute résolution dans la glace liquide ou vitreuse. L’une des étapes les plus critiques du protocole consiste à produire des spécimens avec l’…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient le Dr Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Département d’ophtalmologie) pour avoir fourni AAV-3 purifié. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health et le National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 à D.F.K.).

Materials

Acetone Fisher Scientific  A11-1 1 Liter
Autoloader clipping tool ThermoFisher Scientific N/A Also SubAngstrom supplier
Autoloader grid clips ThermoFisher Scientific N/A top and bottom clips
Carbon-coated gold EM grids Electron Microcopy Sciences CF400-AU-50 400-mesh, 5-nm thickness
COVID-19 patient serum RayBiotech CoV-Pos-S-500 500 microliters of PCR+ serum
Methanol Fisher Scientific  A412-1 1 Liter
Microwell-integrad microchips Protochips, Inc. EPB-42A1-10 10×10-mm window arrays
TEMWindows microchips Simpore Inc. SN100-A10Q33B 9 large windows, 10-nn thick
TEMWindows microchips Simpore, Inc.  SN100-A05Q33A 9 small windows, 5-nm thick
Top microchips Protochips, Inc. EPT-50W 500 mm x 100 mm window
Whatman #1 filter paper Whatman 1001 090 100 pieces, 90 mm
Equipment 
DirectView direct electron detector Direct Electron 6-micron pixel spacing
Falcon 3 EC direct electron detector ThermoFisher Scientific 14-micron pixel spacing
Gatan 655 Dry pump station Gatan, Inc.  Pump holder tip to 10-6 range
Mark IV Vitrobot ThermoFisher Scientific state-of-the-art specimen preparation unit 
PELCO easiGlow, glow discharge unit Ted Pella, Inc.  Negative polarity mode
Poseidon Select specimen holder Protochips, Inc.  FEI compatible;specimen holder
Talos F200C TEM ThermoFisher Scientific 200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3 ThermoFisher Scientific 300 kV; Cryo-TEM
Freely available software Website link Comments (optional)
cryoSPARC https://cryosparc.com/ other image processing software
CTFFIND4 https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 CTF finding program
MotionCorr2 https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELION https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEM https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimera https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ molecular structure analysis software package

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DiCecco, L., Berry, S., Jonaid, G. M., Solares, M. J., Kaylor, L., Gray, J. L., Bator, C., Dearnaley, W. J., Spilman, M., Dressel-Dukes, M. J., Grandfield, K., McDonald Esstman, S. M., Kelly, D. F. Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice. J. Vis. Exp. (185), e63856, doi:10.3791/63856 (2022).

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