تطوير التصوير عالي الدقة لتجميعات الفيروسات في السائل والجليد
Summary
هنا يتم وصف البروتوكولات لإعداد مجموعات الفيروسات المناسبة لتحليل السائل EM و cryo-EM على المستوى النانوي باستخدام المجهر الإلكتروني المرسل.
Abstract
ارتفع الاهتمام بالمجهر الإلكتروني السائل (Liquid-EM) في السنوات الأخيرة حيث يمكن للعلماء الآن مراقبة العمليات في الوقت الفعلي على المستوى النانوي. من المرغوب فيه للغاية إقران معلومات cryo-EM عالية الدقة بالملاحظات الديناميكية حيث تحدث العديد من الأحداث في نطاقات زمنية سريعة – في نطاق ميلي ثانية أو أسرع. يمكن أن تساعد المعرفة المحسنة بالهياكل المرنة أيضا في تصميم كواشف جديدة لمكافحة مسببات الأمراض الناشئة ، مثل SARS-CoV-2. والأهم من ذلك ، أن مشاهدة المواد البيولوجية في بيئة سائلة توفر لمحة فريدة عن أدائها في جسم الإنسان. تظهر هنا طرق مطورة حديثا للتحقيق في الخصائص النانوية لتجمعات الفيروسات في الجليد السائل والزجاجي. لتحقيق هذا الهدف ، تم استخدام عينات محددة جيدا كأنظمة نموذجية. يتم تقديم مقارنات جنبا إلى جنب لطرق تحضير العينات والمعلومات الهيكلية التمثيلية. يتم عرض ميزات النانومتر الفرعي للهياكل التي تم حلها في نطاق ~ 3.5-Å-10 Å. تشمل النتائج الحديثة الأخرى التي تدعم هذا الإطار التكميلي رؤى ديناميكية للقاحات المرشحة والعلاجات القائمة على الأجسام المضادة المصورة في سائل. بشكل عام ، تعمل هذه التطبيقات المترابطة على تعزيز قدرتنا على تصور الديناميات الجزيئية ، مما يوفر سياقا فريدا لاستخدامها في صحة الإنسان والمرض.
Introduction
تعمل البحوث الطبية الحيوية على تحسين فهمنا لصحة الإنسان والمرض من خلال تطوير تقنيات جديدة. يعمل التصوير عالي الدقة على تغيير نظرتنا إلى عالم النانو – مما يسمح لنا بدراسة الخلايا والجزيئات بتفاصيل رائعة1،2،3،4،5. تكشف المعلومات الثابتة للمكونات الديناميكية مثل البوليمرات اللينة أو مجموعات البروتين أو الفيروسات البشرية عن لقطة محدودة فقط من سردها المعقد. لفهم كيفية عمل الكيانات الجزيئية بشكل أفضل ، يجب التحقيق في هيكلها ووظيفتها بشكل مشترك.
توفر التطورات الحديثة في إنتاج مواد مثل الجرافين الرقيق ذريا أو الرقائق الدقيقة القائمة على السيليكون فرصا جديدة لتحليل وظيفة البنية في الوقت الفعلي باستخدام المجاهر الإلكترونية المرسلة (TEMs). يمكن لهذه المواد إنشاء غرف محكمة الغلق للتصوير EM المباشر6،7،8،9،10،11. يوفر المجال الجديد ل Liquid-EM ، درجة حرارة الغرفة المرتبطة ب cryo-EM ، مناظر غير مسبوقة للمواد الصلبة أو اللينة في المحلول ، مما يسمح للعلماء بدراسة بنية وديناميكيات عينتهم في وقت واحد. تشمل تطبيقات Liquid-EM تسجيلات في الوقت الفعلي للجسيمات النانوية العلاجية التي تتفاعل مع الخلايا الجذعية السرطانية بالإضافة إلى التغيرات في التعقيدات الجزيئية لمسببات الأمراض الفيروسية12،13،14.
مثلما حفز التقدم المنهجي ثورة الحل في مجال cryo-EM ، هناك حاجة إلى تقنيات وأساليب جديدة لتوسيع استخدام السائل الكهرومغناطيسي كأداة عالية الإنتاجية للمجتمع العلمي. الهدف العام من الطرق المعروضة هنا هو تبسيط بروتوكولات تحضير عينة السائل EM. الأساس المنطقي وراء التقنيات المطورة هو استخدام تصميمات رقاقة جديدة وأجهزة تحميل تلقائي ، مناسبة لكل من جمع البيانات السائلة و cryo-EM (الشكل 1) 7،14،15،16،17. يتم إغلاق التجميعات ميكانيكيا باستخدام مشابك الشبكة القياسية للأدوات الآلية ، مثل Krios ، والتي يمكن أن تستوعب عينات متعددة لكل جلسة أو F200C TEM (الشكل 2). توسع هذه المنهجية استخدام التصوير عالي الدقة بما يتجاوز تطبيقات cryo-EM القياسية التي توضح أغراضا أوسع لتحليل المواد في الوقت الفعلي.
في مقالة الفيديو الحالية ، يتم تقديم بروتوكولات لإعداد مجموعات الفيروسات في السائل مع وبدون حاملي العينات المتاحة تجاريا. باستخدام حامل العينات المتخصص ل Liquid-EM ، يمكن أن توفر العينات السائلة الرقيقة معلومات هيكلية مماثلة لعينات cryo-EM ، بالإضافة إلى رؤى ديناميكية للعينات. كما تم عرض طرق تحضير العينات السائلة باستخدام أدوات التحميل الآلي لإجراءات الإنتاجية العالية. الميزة الرئيسية على التقنيات الأخرى هي أن الإنتاج الآلي للعينات يسمح للمستخدم بتقييم عيناته بسرعة للحصول على السماكة المثلى وجرعة الإلكترون قبل جمع البيانات. تحدد تقنية الفحص هذه بسرعة المناطق المثالية للتسجيلات في الوقت الفعلي في السائل أو الجليد12،14،18،19. لأغراض تحديد هيكل 3D ، قد يكمل Liquid-EM طرق cryo-EM الراسخة المطبقة في cryo-EM. قد يفكر القراء الذين يستخدمون تقنيات TEM أو cryo-EM التقليدية في استخدام سير عمل السائل الكهرومغناطيسي لتقديم ملاحظات جديدة وديناميكية لعيناتهم بطريقة تكمل استراتيجياتهم الحالية.
تشمل عينات الفيروسات المستخدمة في هذا البروتوكول النوع الفرعي 3 من الفيروس المنقى المرتبط بالغدي (AAV) الذي تم الحصول عليه كهدية واستزراعه في ظل الظروف القياسية12. كما تم استخدام مجموعات غير معدية من فيروس SARS CoV-2 المستمدة من مصل مرضى COVID-1912 وتم الحصول عليها من مصدر تجاري. أخيرا ، تم الحصول على جزيئات مزدوجة الطبقات (DLPs) من فيروس سيميان الروتا المنقى (سلالة SA11) من مختبر الدكتورة سارة إم ماكدونالد إستمان في جامعة ويك فورست واستزراعها باستخدام الظروف القياسية 6،17. حزم البرامج الموضحة هنا متاحة مجانا وتم توفير الروابط في قسم جدول المواد .
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تقديم فرص جديدة لتبسيط سير عمل السائل الكهرومغناطيسي الحالي باستخدام أدوات وتقنيات آلية جديدة مقتبسة من مجال cryo-EM. تعتبر التطبيقات التي تنطوي على تقنية شطيرة الرقاقة الدقيقة الجديدة مهمة فيما يتعلق بالطرق الأخرى لأنها تتيح تحليل التصوير عالي الدقة في الثلج السائل أو الزجاجي. واحدة م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بالدكتور Luk H. Vandenberghe (كلية الطب بجامعة هارفارد ، قسم طب العيون) لتوفير AAV-3 المنقى. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة والمعهد الوطني للسرطان (R01CA193578 ، R01CA227261 ، R01CA219700 إلى DFK).
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10×10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
References
- Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
- Oikonomou, C. M., Chang, Y. -. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
- Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
- Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
- Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
- Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
- Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80 (2018).
- Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).
- Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
- Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
- Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
- Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
- Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
- Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
- Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
- Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
- Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).
