Summary

Establecer organoides a partir de dientes humanos como una herramienta poderosa hacia la investigación mecanicista y la terapia regenerativa

Published: April 13, 2022
doi:

Summary

Presentamos un protocolo para desarrollar cultivos de organoides epiteliales a partir de dientes humanos. Los organoides son robustamente expandibles y recapitulan las células madre epiteliales del diente, incluida su capacidad de diferenciación de ameloblastos. El modelo organoide único proporciona una herramienta prometedora para estudiar la biología dental humana (células madre) con perspectivas para enfoques regenerativos de dientes.

Abstract

Los dientes son de importancia clave en la vida no solo para la masticación de los alimentos y el habla, sino también para el bienestar psicológico. El conocimiento sobre el desarrollo de los dientes humanos y la biología es escaso. En particular, no se sabe mucho sobre las células madre epiteliales del diente y su función. Logramos desarrollar un nuevo modelo organoide a partir de tejido dental humano (es decir, folículo dental, aislado de muelas del juicio extraídas). Los organoides son expandibles de forma robusta y a largo plazo y recapitulan el compartimento de células madre epiteliales del diente humano propuesto en términos de expresión de marcadores, así como de actividad funcional. En particular, los organoides son capaces de desplegar un proceso de diferenciación de ameloblastos como ocurre in vivo durante la amelogénesis. Este modelo organoide único proporcionará una herramienta poderosa para estudiar no solo el desarrollo de los dientes humanos, sino también la patología dental, y puede allanar el camino hacia la terapia regenerativa dental. Reemplazar los dientes perdidos con un diente biológico basado en este nuevo modelo de organoides podría ser una alternativa atractiva a la implantación estándar actual de materiales sintéticos.

Introduction

Los dientes tienen funciones esenciales en la masticación de los alimentos, el habla y el bienestar psicológico (autoimagen). El diente humano consiste en tejidos altamente mineralizados de densidad y dureza variables1. El esmalte dental, el componente principal de la corona dental, es el tejido mineralizado más alto del cuerpo humano. Durante la formación del esmalte (amelogénesis), cuando se desarrollan los dientes, las células madre epiteliales dentales (DESC) se diferencian en células formadoras de esmalte (ameloblastos). Una vez formado, el esmalte rara vez se repara o renueva debido a la pérdida apoptótica de los ameloblastos al inicio de la erupción dental1. La restauración del tejido del esmalte dañado, causado por un traumatismo o enfermedad bacteriana, se realiza actualmente utilizando materiales sintéticos; sin embargo, estos están preocupados por deficiencias importantes como la microcongestión, la osteointegración y el anclaje inferiores, la vida útil finita y la falta de reparación completamente funcional2. Por lo tanto, un cultivo robusto y confiable de DESC humanos con la capacidad de generar ameloblastos y el potencial de producir tejido mineralizado sería un gran paso adelante en el campo de la regeneración dental.

El conocimiento sobre el fenotipo DELSC humano y la función biológica son escasos 3,4,5. Curiosamente, se ha propuesto que los DESC de los dientes humanos existen en los restos de células epiteliales de Malassez (ERM), grupos celulares presentes dentro del folículo dental (DF), que rodea los dientes no erupcionados y permanece presente en el ligamento periodontal alrededor de la raíz una vez que el diente entra en erupción1. Se ha encontrado que las células ERM cocultivadas con pulpa dental se diferencian en células similares a los ameloblastos y generan tejido similar al esmalte6. Sin embargo, los estudios profundos sobre el papel específico de las células ERM en la (re)generación de esmalte han sido limitados debido a la falta de modelos de estudio confiables7. Los sistemas actuales de cultivo in vitro ERM se ven obstaculizados por la vida útil limitada y la rápida pérdida de fenotipo en las condiciones 2D utilizadas estándarmente 8,9,10,11,12. Por lo tanto, se necesita un sistema in vitro manejable para expandir, estudiar y diferenciar fielmente los DESC humanos.

Durante la última década, una poderosa técnica para cultivar células madre epiteliales in vitro se ha aplicado con éxito a varios tipos de tejidos epiteliales (humanos) para estudiar su biología, así como la enfermedad 13,14,15,16. Esta tecnología permite que las células madre epiteliales tisulares se desarrollen automáticamente en construcciones de células 3D (es decir, organoides) cuando se siembran en un andamio que imita la matriz extracelular (ECM) (típicamente, Matrigel) y se cultivan en un medio definido que replica la señalización del nicho de células madre del tejido y / o la embriogénesis. Los factores de crecimiento típicos necesarios para el desarrollo de organoides incluyen el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y los activadores del sitio de integración MMTV (WNT) de tipo sin alas 14,15,16. Los organoides resultantes se caracterizan por una fidelidad duradera en la imitación de las células madre epiteliales originales del tejido, así como una alta capacidad de expansión al tiempo que conservan su fenotipo y propiedades funcionales, superando así la disponibilidad de tejido humano primario a menudo limitada adquirida en la clínica. Para establecer organoides, no se requiere el aislamiento de las células madre epiteliales del tejido heterogéneo (es decir, que comprende otros tipos de células, como las células mesenquimales) antes del cultivo, ya que las células mesenquimales no se adhieren o prosperan en la ECM, lo que eventualmente resulta en organoides puramente epiteliales 13,16,17,18,19 . Esta tecnología prometedora y versátil ha llevado al desarrollo de múltiples modelos organoides a partir de diversos tejidos epiteliales humanos. Sin embargo, los organoides derivados de dientes humanos, valiosos para el estudio profundo del desarrollo, la regeneración y la enfermedad de los dientes, aún no se han establecido20,21. Recientemente logramos desarrollar un nuevo modelo organoide a partir de tejido DF a partir de terceros molares (muelas del juicio) extraídos de pacientes adolescentes19.

Aquí, describimos el protocolo para desarrollar cultivos de organoides epiteliales a partir del diente humano adulto (es decir, a partir del DF de terceros molares) (Figura 1A). Los organoides resultantes expresan marcadores de tallo asociados a ERM mientras que son expandibles a largo plazo. Curiosamente, a diferencia de la mayoría de los otros modelos de organoides, el EGF típicamente necesario es redundante para el desarrollo y crecimiento de organoides robustos. Curiosamente, los organoides del tallo muestran propiedades de diferenciación de ameloblastos, imitando así las características y procesos de ERM / DESC que ocurren in vivo. El nuevo y único modelo organoide descrito aquí permite explorar la biología, la plasticidad y la capacidad de diferenciación de DESC y abre la puerta para dar los primeros pasos hacia enfoques regenerativos de los dientes.

Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité de Ética de Investigación UZ/KU Leuven (13/0104U). Los terceros molares extraídos (muelas del juicio) se obtuvieron después del consentimiento informado de los pacientes. 1. Preparativos Precalentar una placa de cultivo de 48 pocillos durante 15-20 h en una incubadora de CO2 al 1,9% a 37 °C. Licuar una alícuota de Matrigel (factor de crecimiento reducido; libre de rojo de …

Representative Results

Desarrollo de organoides dentalesProporcionamos un protocolo detallado para establecer cultivos de organoides a partir de tejido DF humano adquirido después de la extracción de muelas del juicio (Figura 1A). La DF aislada se disocia enzimática y mecánicamente. Las células obtenidas se cultivan dentro de BMM en medios que se definieron empíricamente para el desarrollo y crecimiento óptimo de organoides (medio organoide dental; TOM)19. <p…

Discussion

Este protocolo describe la generación eficiente y reproducible de organoides a partir del diente humano. Hasta donde sabemos, esta es la primera metodología para establecer organoides de concepto actual (epitelial) a partir de tejido dental humano. Los organoides son expandibles a largo plazo y muestran un fenotipo de tallo epitelial dental, duplicando los DESC previamente reportados en el compartimiento ERM del DF7. Además, los organoides replican las características funcionales de DESC/ERM, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a todos los miembros del personal de Cirugía Oral y Maxilofacial (MKA) de UZ Leuven, así como a los pacientes, por su inestimable ayuda en la recolección de terceros molares recién extraídos. También nos gustaría agradecer a la Dra. Reinhilde Jacobs y a la Dra. Elisabeth Tijskens por su ayuda con la recolección de muestras. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de KU Leuven (BOF) y FWO-Flanders (G061819N). L.H. es un FWO Ph.D. Fellow (1S84718N).

Materials

1.5 mL Microcentrifuge tube Eppendorf 30120.086
15 mL Centrifuge tube Corning 430052
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M-6250
48-well flat bottom plates Corning 3548
50 mL Centrifuge tube Corning 430290
A83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Agarose Lonza 50004
Albumin Bovine (cell culture grade) Serva 47330.03
AMELX antibody Santa Cruz sc-365284
Amphotericin B Gibco 15200018
B27 (without vitamin A) Gibco 12587-010
Cassette VWR 7202191
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C100
CD44 antibody Abcam ab34485
Cell strainer, 40 µm Falcon 352340
Cholera Toxin Sigma-Aldrich C8052
Citric acid Sigma-Aldrich C0759
CK14 antibody Thermo Fisher Scientific MA5-11599
Collagenase IV Gibco 17104-019
Cover glass VWR 6310146
Cryobox Thermo Scientific 5100-0001
Cryovial Thermo Fisher Scientific 375353
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dispase II Sigma-Aldrich D4693
DMEM 1:1 F12 without Fe Invitrogen 074-90715A
DMEM powder high glucose Gibco 52100039
Dnase Sigma-Aldrich D5025-15KU
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 – 10ML
Embedding workstation, 220 to 240 Vac Thermo Fisher Scientific 12587976
Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) Fisher Chemical E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
FGF10 Peprotech 100-26
FGF2 (= basic FGF) R&D Systems 234-FSE-025
FGF8 Peprotech AF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit Sigma-Aldrich RTN350-1KT Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer
Glass Pasteur pipette Niko Mechanisms 170-40050
Glycine VWR 101194M
HEPES Sigma-Aldrich H4034
IGF-1 PeproTech 100-11
InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) Sigma-Aldrich 688001
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I6634
ITGA6 antibody Sigma-Aldrich HPA012696
L-Glutamine Gibco 25030024
Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) Corning 15505739
Microscope slide Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm Millipore SLGV033R
Minimum essential medium eagle (αMEM) Sigma-Aldrich M4526
mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-31570
N2 Gibco 17502-048
N-acetyl L-cysteine Sigma-Aldrich A7250
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Noggin PeproTech 120-10C
P63 antibody Abcam ab124762
Pap Pen Sigma-Aldrich Z377821-1EA Marking pen
Paraformaldehyde (PFA), 16% Merck 8.18715
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich P3032
Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) Gibco 15140-122
Petri dish Corning 353002
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010-015
Pipette (P20, P200, P1000) Eppendorf or others 2231300006
Plastic transfer pipette (3.5 mL) Sarstedt 86.1171.001
Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody Thermo Fisher Scientific A21206
RSPO1 PeproTech 120-38
SB202190 (p38i) Biotechne (Tocris) 1264
Scalpel (surgical blade) Swann-Morton 207
SHH R&D Systems 464-SH-200
Silicone molds (Heating block) VWR 720-1918
Sodium Chloride (NaCl) BDH 102415K
Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) Merck 106329
Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) Sigma-Aldrich P-5280
SOX2 antibody Abcam ab92494
StepOnePlus Thermo Fisher Scientific Real-Time PCR System
Stericup-GP, 0.22 µm Millipore SCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm Millipore SCGP00525
Sterile 1000 μL pipette tips with filter Greiner 740288
Sterile 20 μL pipette tips with filter Greiner 774288
Sterile 200 μL pipette tips with and without filter Greiner 739288
Sterile H2O Fresenius B230531
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich S6501
Superscript III first-strand synthesis supermix Invitrogen 11752-050 Reverse transcription kit
Tissue processor Thermo Scientific 12505356
Transferrin Serva 36760.01
Triton X-100 Sigma T8787-50ML
TrypLE express Gibco 12605-010
Vectashield mounting medium+DAPI Labconsult NV H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
WNT3a Biotechne (Tocris) 5036-WN-500
Xylenes, 99%, for biochemistry and histology VWR 2,89,75,325

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Cite This Article
Hemeryck, L., Lambrichts, I., Bronckaers, A., Vankelecom, H. Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy. J. Vis. Exp. (182), e63671, doi:10.3791/63671 (2022).

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