Summary

Etablierung von Organoiden aus dem menschlichen Zahn als mächtiges Werkzeug für die mechanistische Forschung und regenerative Therapie

Published: April 13, 2022
doi:

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll zur Entwicklung epithelialer Organoidkulturen ausgehend vom menschlichen Zahn. Die Organoide sind robust expandierbar und rekapitulieren die epithelialen Stammzellen des Zahnes, einschließlich ihrer Ameloblasten-Differenzierungskapazität. Das einzigartige Organoidmodell bietet ein vielversprechendes Werkzeug, um die Biologie der menschlichen Zahnmedizin (Stammzelle) mit Perspektiven für zahnregenerative Ansätze zu untersuchen.

Abstract

Zähne sind von entscheidender Bedeutung im Leben, nicht nur für den Kauen und die Sprache, sondern auch für das psychische Wohlbefinden. Das Wissen über die Entwicklung und Biologie des menschlichen Zahns ist knapp. Insbesondere ist nicht viel über die epithelialen Stammzellen des Zahnes und ihre Funktion bekannt. Es ist uns gelungen, ein neuartiges Organoidmodell zu entwickeln, das auf menschlichem Zahngewebe (d.h. Zahnfollikel, isoliert aus extrahierten Weisheitszähnen) basiert. Die Organoide sind robust und langfristig erweiterbar und rekapitulieren das vorgeschlagene epitheliale Stammzellkompartiment des menschlichen Zahnes sowohl in Bezug auf die Markerexpression als auch auf die funktionelle Aktivität. Insbesondere sind die Organoide in der Lage, einen Ameloblastendifferenzierungsprozess zu entfalten, wie er in vivo während der Amelogenese abläuft. Dieses einzigartige Organoidmodell wird ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung nicht nur der Entwicklung des menschlichen Zahnes, sondern auch der Zahnpathologie bieten und den Weg für eine zahnregenerative Therapie ebnen. Der Ersatz verlorener Zähne durch einen biologischen Zahn, der auf diesem neuen Organoidmodell basiert, könnte eine attraktive Alternative zur derzeitigen Standardimplantation von synthetischen Materialien sein.

Introduction

Zähne spielen eine wesentliche Rolle beim Kauen von Lebensmitteln, bei der Sprache und beim psychischen Wohlbefinden (Selbstbild). Der menschliche Zahn besteht aus hochmineralisiertem Gewebe unterschiedlicher Dichte und Härte1. Zahnschmelz, der Hauptbestandteil der Zahnkrone, ist das am höchsten mineralisierte Gewebe im menschlichen Körper. Während der Schmelzbildung (Amelogenese), wenn sich Zähne entwickeln, differenzieren sich zahnepitheliale Stammzellen (DESCs) in schmelzbildende Zellen (Ameloblasten). Einmal gebildet, wird der Zahnschmelz aufgrund des apoptotischen Verlustes der Ameloblasten zu Beginn des Zahnausbruchs selten repariert oder erneuert1. Die Wiederherstellung von beschädigtem Schmelzgewebe, wie es durch Trauma oder bakterielle Erkrankungen verursacht wird, wird derzeit mit synthetischen Materialien durchgeführt; Diese sind jedoch mit wichtigen Mängeln wie Mikroleckage, minderwertiger Osseointegration und Verankerung, begrenzter Lebensdauer und fehlender voll funktionsfähiger Reparaturkonfrontiert 2. Daher wäre eine robuste und zuverlässige Kultur menschlicher DESCs mit der Fähigkeit, Ameloblasten zu erzeugen und das Potenzial, mineralisiertes Gewebe zu produzieren, ein großer Schritt vorwärts im Bereich der dentalen Regenerative.

Das Wissen über den menschlichen DESC-Phänotyp und die biologische Funktion ist knapp 3,4,5. Interessanterweise wurde vorgeschlagen, dass DESCs menschlicher Zähne in den Epithelzellresten von Malassez (ERM) existieren, Zellclustern, die im Zahnfollikel (DF) vorhanden sind, der nicht durchgebrochene Zähne umgibt und im Parodontalband um die Wurzel vorhanden bleibt, sobald der Zahn ausbricht1. Es wurde festgestellt, dass ERM-Zellen, die mit Zahnpulpa kokultiviert werden, sich in ameloblastenähnliche Zellen differenzieren und schmelzähnliches Gewebeerzeugen 6. Tiefgreifende Studien über die spezifische Rolle von ERM-Zellen bei der (Re-) Erzeugung von Zahnschmelzzellen waren jedoch aufgrund des Mangels an zuverlässigen Studienmodellen begrenzt7. Aktuelle ERM-In-vitro-Kultursysteme werden durch eine begrenzte Lebensdauer und einen schnellen Verlust des Phänotyps unter den standardmäßig verwendeten 2D-Bedingungen 8,9,10,11,12 behindert. Daher ist ein handhabbares In-vitro-System zur originalgetreuen Erweiterung, Untersuchung und Differenzierung menschlicher DESCs dringend erforderlich.

In den letzten zehn Jahren wurde eine leistungsfähige Technik zur Züchtung epithelialer Stammzellen in vitro erfolgreich auf verschiedene Arten von (menschlichen) Epithelgeweben angewendet, um ihre Biologie sowie die Krankheit13,14,15,16 zu untersuchen. Diese Technologie ermöglicht es den epithelialen Stammzellen des Gewebes, sich selbst zu 3D-Zellkonstruktionen (d. H. Organoiden) zu entwickeln, wenn sie in ein extrazelluläres Matrix (ECM) -imitierendes Gerüst (typischerweise Matrigel) gesät und in einem definierten Medium kultiviert werden, das die Stammzell-Nischensignalisierung des Gewebes und / oder die Embryogenese repliziert. Typische Wachstumsfaktoren, die für die Organoidentwicklung benötigt werden, sind der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und die wingless-Typ MMTV Integration Site (WNT) Aktivatoren14,15,16. Die resultierenden Organoide zeichnen sich durch dauerhafte Genauigkeit bei der Nachahmung der ursprünglichen Epithelstammzellen des Gewebes sowie durch eine hohe Erweiterbarkeit unter Beibehaltung ihres Phänotyps und ihrer funktionellen Eigenschaften aus, wodurch die oft begrenzte primäre Verfügbarkeit von menschlichem Gewebe, wie sie in der Klinik erworben wurde, überwunden wird. Um Organoide zu etablieren, ist eine Isolierung der epithelialen Stammzellen aus dem heterogenen Gewebe (d.h. bestehend aus anderen Zelltypen wie mesenchymalen Zellen) vor der Kultivierung nicht erforderlich, da mesenchymale Zellen nicht an das ECM binden oder darin gedeihen, was schließlich zu rein epithelialen Organoiden führt 13,16,17,18,19 . Diese vielversprechende und vielseitige Technologie hat zur Entwicklung vielfältiger Organoidmodelle aus verschiedenen menschlichen Epithelgeweben geführt. Aus menschlichem Zahn gewonnene Organoide, die für die eingehende Untersuchung der Zahnentwicklung, -regeneration und -krankheit wertvoll sind, wurden jedoch noch nicht etabliert20,21. Kürzlich ist es uns gelungen, ein solches neues Organoidmodell zu entwickeln, das von DF-Gewebe aus dritten Molaren (Weisheitszähnen) ausgeht, die von jugendlichen Patienten19 extrahiert wurden.

Hier beschreiben wir das Protokoll zur Entwicklung epithelialer Organoidkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Zahn (d.h. aus dem DF der dritten Molaren) (Abbildung 1A). Die resultierenden Organoide exprimieren ERM-assoziierte Stammheitsmarker und sind gleichzeitig langfristig erweiterbar. Interessanterweise ist im Gegensatz zu den meisten anderen Organoidmodellen der normalerweise benötigte EGF für eine robuste Organoidentwicklung und -entwicklung redundant. Interessanterweise zeigen die Stammheitsorganoide Ameloblastendifferenzierungseigenschaften, wodurch ERM/DESC-Merkmale und -Prozesse nachgeahmt werden, die in vivo auftreten. Das hier beschriebene neue und einzigartige Organoidmodell ermöglicht die Erforschung der DESC-Biologie, Plastizität und Differenzierungskapazität und öffnet die Tür für die ersten Schritte in Richtung zahnregenerativer Ansätze.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden von der Ethikkommission Forschung UZ/KU Leuven (13/0104U) genehmigt. Extrahierte dritte Molaren (Weisheitszähne) wurden nach der informierten Zustimmung der Patienten erhalten. 1. Vorbereitungen Eine 48-Well-Kulturplatte für 15-20 h in einem 1,9% CO 2-Inkubator bei 37 °C vorwärmen. Verflüssigen Sie ein Matrigel aliquot (Wachstumsfaktor-reduziert; phenolrotfrei; weiter als Basalmembranmatrix bezeichnet;…

Representative Results

Entwicklung von ZahnorganoidenWir bieten ein detailliertes Protokoll zur Etablierung von Organoidkulturen aus menschlichem DF-Gewebe, das nach der Weisheitszahnextraktion gewonnen wurde (Abbildung 1A). Isolierte DF ist enzymatisch und mechanisch dissoziiert. Die erhaltenen Zellen werden innerhalb von BMM in Medien kultiviert, die empirisch für eine optimale Organoidentwicklung und -wachstum (Zahnorganoidmedium; TOM)19. <p class="jove_content"…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die effiziente und reproduzierbare Erzeugung von Organoiden ausgehend vom menschlichen Zahn. Unseres Wissens ist dies die erste Methodik zur Etablierung von (epithelialen) Organoiden des aktuellen Konzepts, ausgehend von menschlichem Zahngewebe. Die Organoide sind langfristig expandierbar und zeigen einen Phänotyp der Zahnepithelstammigkeit, der DESCs dupliziert, die zuvor im ERM-Kompartiment des DF7 berichtet wurden. Darüber hinaus replizieren die Organoide funktione…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie (MKA) der UZ Leuven sowie den Patienten für ihre unschätzbare Hilfe beim Sammeln frisch extrahierter dritter Molaren. Wir danken auch Dr. Reinhilde Jacobs und Dr. Elisabeth Tijskens für ihre Hilfe bei der Probensammlung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der KU Leuven (BOF) und der FWO-Flanders (G061819N) unterstützt. L.H. ist ein FWO Ph.D. Fellow (1S84718N).

Materials

1.5 mL Microcentrifuge tube Eppendorf 30120.086
15 mL Centrifuge tube Corning 430052
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M-6250
48-well flat bottom plates Corning 3548
50 mL Centrifuge tube Corning 430290
A83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Agarose Lonza 50004
Albumin Bovine (cell culture grade) Serva 47330.03
AMELX antibody Santa Cruz sc-365284
Amphotericin B Gibco 15200018
B27 (without vitamin A) Gibco 12587-010
Cassette VWR 7202191
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C100
CD44 antibody Abcam ab34485
Cell strainer, 40 µm Falcon 352340
Cholera Toxin Sigma-Aldrich C8052
Citric acid Sigma-Aldrich C0759
CK14 antibody Thermo Fisher Scientific MA5-11599
Collagenase IV Gibco 17104-019
Cover glass VWR 6310146
Cryobox Thermo Scientific 5100-0001
Cryovial Thermo Fisher Scientific 375353
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dispase II Sigma-Aldrich D4693
DMEM 1:1 F12 without Fe Invitrogen 074-90715A
DMEM powder high glucose Gibco 52100039
Dnase Sigma-Aldrich D5025-15KU
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 – 10ML
Embedding workstation, 220 to 240 Vac Thermo Fisher Scientific 12587976
Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) Fisher Chemical E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
FGF10 Peprotech 100-26
FGF2 (= basic FGF) R&D Systems 234-FSE-025
FGF8 Peprotech AF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit Sigma-Aldrich RTN350-1KT Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer
Glass Pasteur pipette Niko Mechanisms 170-40050
Glycine VWR 101194M
HEPES Sigma-Aldrich H4034
IGF-1 PeproTech 100-11
InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) Sigma-Aldrich 688001
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I6634
ITGA6 antibody Sigma-Aldrich HPA012696
L-Glutamine Gibco 25030024
Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) Corning 15505739
Microscope slide Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm Millipore SLGV033R
Minimum essential medium eagle (αMEM) Sigma-Aldrich M4526
mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-31570
N2 Gibco 17502-048
N-acetyl L-cysteine Sigma-Aldrich A7250
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Noggin PeproTech 120-10C
P63 antibody Abcam ab124762
Pap Pen Sigma-Aldrich Z377821-1EA Marking pen
Paraformaldehyde (PFA), 16% Merck 8.18715
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich P3032
Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) Gibco 15140-122
Petri dish Corning 353002
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010-015
Pipette (P20, P200, P1000) Eppendorf or others 2231300006
Plastic transfer pipette (3.5 mL) Sarstedt 86.1171.001
Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody Thermo Fisher Scientific A21206
RSPO1 PeproTech 120-38
SB202190 (p38i) Biotechne (Tocris) 1264
Scalpel (surgical blade) Swann-Morton 207
SHH R&D Systems 464-SH-200
Silicone molds (Heating block) VWR 720-1918
Sodium Chloride (NaCl) BDH 102415K
Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) Merck 106329
Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) Sigma-Aldrich P-5280
SOX2 antibody Abcam ab92494
StepOnePlus Thermo Fisher Scientific Real-Time PCR System
Stericup-GP, 0.22 µm Millipore SCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm Millipore SCGP00525
Sterile 1000 μL pipette tips with filter Greiner 740288
Sterile 20 μL pipette tips with filter Greiner 774288
Sterile 200 μL pipette tips with and without filter Greiner 739288
Sterile H2O Fresenius B230531
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich S6501
Superscript III first-strand synthesis supermix Invitrogen 11752-050 Reverse transcription kit
Tissue processor Thermo Scientific 12505356
Transferrin Serva 36760.01
Triton X-100 Sigma T8787-50ML
TrypLE express Gibco 12605-010
Vectashield mounting medium+DAPI Labconsult NV H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
WNT3a Biotechne (Tocris) 5036-WN-500
Xylenes, 99%, for biochemistry and histology VWR 2,89,75,325

References

  1. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
  2. Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
  3. Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L., Zavan, B., Bressan, E. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. , (2016).
  4. Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).
  5. Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).
  6. Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
  7. Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
  8. Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
  9. Kim, G. -. H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
  10. Nam, H., et al. Establishment of Hertwig’s epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
  11. Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
  12. Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
  13. Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
  14. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  15. Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
  18. Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
  19. Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).
  20. Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
  21. Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).
  22. Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
  23. Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig’s epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
  24. Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
  25. Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn’t orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
  26. Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
  27. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  28. Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
  29. Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  30. Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).
  31. . Future Health Biobank Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022)
  32. Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).
  33. Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).
  34. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  35. Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).
  36. Mollaki, V. Ethical challenges in organoid use. BioTech. 10 (3), 12 (2021).

Play Video

Cite This Article
Hemeryck, L., Lambrichts, I., Bronckaers, A., Vankelecom, H. Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy. J. Vis. Exp. (182), e63671, doi:10.3791/63671 (2022).

View Video