Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

Para las proteínas, la elucidación de la dinámica junto con el conocimiento estructural tridimensional (3-D) conduce a una mejor comprensión de las relaciones estructura-función de los sistemas biomoleculares. Los métodos estructurales, como la cristalografía de rayos X y la microscopía electrónica criogénica, capturan una estructura estática y, a menudo, requieren la determinación de múltiples estructuras para dilucidar aspectos de la unión y dinámica de biomoléculas¹. En este artículo se describe un método basado en soluciones para mapear elementos estructurales globales, como sitios de enlace o interacciones de enlace, que son potencialmente más transitorios y menos fáciles de capturar mediante métodos estáticos. Los sistemas candidatos fuertes para esta metodología son aquellos en los que una estructura 3-D ha sido previamente determinada por cristalografía de rayos X, espectroscopia de RMN u otros métodos estructurales. En este caso, aprovechamos la estructura cristalina de rayos X del complejo SecA-SecYEG, un actor central en la vía secretora general de la proteína, para mapear la ubicación de un sitio de unión al péptido señal utilizando la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) antes del transporte de la preproteína a través de la membrana². La manipulación del sistema biológico a través de modificaciones genéticas junto con nuestro conocimiento de la estructura 3-D permitió la determinación de la conformación de la secuencia de señal y la región madura temprana inmediatamente antes de la inserción en el canal ³.

FRET implica la transferencia de energía sin radiación de una molécula (donante) a otra (aceptor) de una manera dependiente de la distancia que es a través del espacio ^4,5. La eficiencia de esta transferencia se controla a través de una disminución en el donante o un aumento en la intensidad de la fluorescencia del aceptor. La eficiencia de la transferencia de energía se puede describir como

E = R₀⁶/(R₀⁶ + R⁶)

en el que el valor R₀ es la distancia a la que la transferencia es 50% eficiente⁶. La técnica ha sido descrita previamente como una regla molecular y es efectiva para determinar distancias en el rango de 2.5-12 nm, dependiendo de la identidad de los colorantes donante-aceptor 4,7,8,9. Las intensidades de fluorescencia del donante y las vidas útiles con o sin aceptor permiten determinar las eficiencias de transferencia y, en consecuencia, las distancias ^5,8. Debido a la disponibilidad de la tecnología, la sensibilidad del método y la facilidad de uso, FRET también ha encontrado una amplia aplicación en áreas como la espectroscopia de fluorescencia de molécula única y la microscopía confocal⁶. El advenimiento de proteínas fluorescentes como la proteína fluorescente verde ha hecho que la observación de la dinámica intracelular y las imágenes de células vivas sean relativamente^{fáciles 10,11}. Muchas aplicaciones FRET como estas se discuten en detalle en este número virtual.

En este estudio, nos centramos particularmente en el uso de mediciones FRET para obtener valores de distancia para determinar detalles estructurales. Anteriormente, las mediciones de FRET se han utilizado eficazmente para determinar la conformación de las moléculas de ADN cuando se unen a la proteína ^12,13,14, la dinámica interna de las proteínas y las interacciones de unión a proteínas ^15,16,17. Las ventajas de este método radican en la capacidad de determinar elementos estructurales flexibles y dinámicos en una solución con cantidades relativamente bajas de material. Significativamente, este método es particularmente efectivo cuando se usa junto con la información estructural existente y no se puede usar como un medio de determinación de la estructura 3D. El método proporciona la mejor visión y refinamiento de la estructura si el trabajo se basa en la información estructural existente a menudo junto con la simulación computacional^18,19. Aquí, se describe el uso de distancias obtenidas de mediciones FRET en estado estacionario y resueltas en el tiempo para mapear un sitio de unión, cuya ubicación no se conocía, en una estructura cristalográfica existente del complejo SecA-SecYEG, proteínas principales en la vía secretora general³.

La vía secretora general, un sistema altamente conservado desde procariotas hasta eucariotas y arqueas, media el transporte de proteínas a través o dentro de la membrana a su ubicación funcional en la célula. Para las bacterias Gram-negativas, como E. coli, el organismo utilizado en nuestro estudio, las proteínas se insertan o translocan a través de la membrana interna hasta el periplasma. El complejo del canal SecY bacteriano (denominado translocon) se coordina con otras proteínas para translocar la proteína recién sintetizada, que se dirige a su ubicación correcta en la célula a través de una secuencia de señal típicamente ubicada en el extremo N^20,21. Para las proteínas unidas al periplasma, la proteína ATPasa SecA se asocia con el túnel de salida del ribosoma, y con la preproteína después de que se hayan traducido aproximadamente 100 residuos²². Junto con la proteína chaperona SecB, mantiene la preproteína en un estado desplegado. SecA se une al translocón SecYEG, y a través de muchos ciclos de hidrólisis de ATP, facilita el transporte de proteínas a través de la membrana^23,24.

SecA es una proteína multidominio que existe en formas citosólicas y unidas a la membrana. Una proteína homodimérica en el citosol, SecA consiste en un dominio de unión preproteica o de reticulación²⁵, dos dominios de unión a nucleótidos, un dominio de ala helicoidal, un dominio de andamio helicoidal y el dedo de dos hélices (THF)26,27,28,29 (Figura 1). En estudios cristalográficos previos del complejo SecA-SecYEG, la ubicación del THF sugirió que participaba activamente en la translocación de proteínas y los experimentos posteriores de reticulación con el péptido señal establecieron aún más la importancia de esta región en la translocación de proteínas^30,31. Estudios previos, utilizando la metodología de mapeo FRET, demostraron que los péptidos señal exógenos se unen a esta región de SecA ^2,32. Para comprender completamente la conformación y la ubicación de la secuencia de señal y la región madura temprana de la preproteína antes de la inserción en el canal SecYEG, se creó una quimera de proteínas en la que la secuencia de señales y los residuos de la región madura temprana se unieron a SecA a través de un enlazador Ser-Gly (Figura 1). Utilizando esta construcción biológicamente viable, se demostró además que la secuencia de señales y la región madura temprana de la preproteína se unen al THF de manera paralela². Posteriormente, se utilizó la metodología de mapeo FRET para dilucidar la conformación y localización de la secuencia de señales y la región madura temprana en presencia de SecYEG como se describe a continuación³.

El conocimiento de la estructura 3-D del complejo SecA-SecYEG 33,34,35 y la posible ubicación del sitio de unión nos permitió colocar juiciosamente etiquetas donante-aceptor en lugares donde la intersección de distancias FRET individuales identifica la ubicación del sitio de unión. Estas mediciones de mapeo FRET revelaron que la secuencia de señales y la región madura temprana de la preproteína forman una horquilla con la punta ubicada en la boca del canal SecYEG, lo que demuestra que la estructura de la horquilla se modela antes de la inserción del canal.