Förster Resonance Energy Transfer Mapping: een nieuwe methodologie om wereldwijde structurele kenmerken op te helderen

Voor eiwitten leidt opheldering van dynamica samen met 3-dimensionale (3D) structurele kennis tot een beter begrip van structuur-functierelaties van biomoleculaire systemen. Structurele methoden, zoals röntgenkristallografie en cryogene elektronenmicroscopie, vangen een statische structuur op en vereisen vaak de bepaling van meerdere structuren om aspecten van biomolecuulbinding en dynamica op te helderen¹. In dit artikel wordt een oplossingsgerichte methode besproken voor het in kaart brengen van globale structurele elementen, zoals bindingsplaatsen of bindingsinteracties, die mogelijk meer van voorbijgaande aard zijn en minder gemakkelijk kunnen worden vastgelegd door statische methoden. Sterke kandidaatsystemen voor deze methodologie zijn systemen waarin een 3D-structuur eerder is bepaald door röntgenkristallografie, NMR-spectroscopie of andere structurele methoden. In dit geval maken we gebruik van de röntgenkristalstructuur van het SecA-SecYEG-complex, een centrale speler in de eiwit-algemene secretoire route, om de locatie van een signaalpeptidebindingsplaats in kaart te brengen met behulp van Förster resonantie-energieoverdracht (FRET) voorafgaand aan het transport van het preproteïne over het membraan². Manipulatie van het biologische systeem door genetische modificaties in combinatie met onze kennis van de 3D-structuur maakte het mogelijk om de conformatie van de signaalsequentie en het vroege volwassen gebied te bepalen onmiddellijk voorafgaand aan het inbrengen in het kanaal ³.

FRET omvat de stralingsloze overdracht van energie van het ene molecuul (donor) naar het andere (acceptor) op een afstandsafhankelijke manier die door de ruimte is ^4,5. De efficiëntie van deze overdracht wordt bewaakt door een afname van de donor of een toename van de fluorescentie-intensiteit van de acceptor. De efficiëntie van energieoverdracht kan worden omschreven als

E = R₀⁶/(R₀⁶ + R⁶)

waarbij de R_0-waarde de afstand is waarop de overdracht 50% efficiënt is⁶. De techniek is eerder beschreven als een moleculaire liniaal en is effectief in het bepalen van afstanden in het bereik van 2,5-12 nm, afhankelijk van de identiteit van de donor-acceptorkleurstoffen 4,7,8,9. De fluorescentie-intensiteiten en levensduur van de donor met of zonder acceptor maken het mogelijk om de overdrachtsefficiënties en bijgevolg de afstanden ^5,8 te bepalen. Vanwege de beschikbaarheid van de technologie, de gevoeligheid van de methode en het gebruiksgemak, heeft FRET ook een brede toepassing gevonden op gebieden als fluorescentiespectroscopie met één molecuul en confocale microscopie⁶. De komst van fluorescerende eiwitten zoals groen fluorescerend eiwit heeft de waarneming van intracellulaire dynamica en live-cell imaging relatief gemakkelijk gemaakt^10,11. Veel FRET-toepassingen zoals deze worden in dit virtuele nummer in detail besproken.

In deze studie richten we ons vooral op het gebruik van FRET-metingen om afstandswaarden te genereren om structurele details te bepalen. Voorheen werden FRET-metingen effectief gebruikt om de conformatie van DNA-moleculen te bepalen wanneer ze gebonden zijn aan eiwit 12,13,14, de interne dynamiek van eiwitten en eiwitbindingsinteracties 15,16,17. De voordelen van deze methode liggen in de mogelijkheid om flexibele en dynamische structurele elementen te bepalen in een oplossing met relatief lage hoeveelheden materiaal. Het is veelzeggend dat deze methode bijzonder effectief is wanneer deze wordt gebruikt in combinatie met bestaande structurele informatie en niet kan worden gebruikt als een middel voor 3D-structuurbepaling. De methode biedt het beste inzicht en de verfijning van de structuur als het werk voortbouwt op bestaande structurele informatie, vaak gekoppeld aan computationele simulatie^18,19. Hier wordt het gebruik van afstanden verkregen uit steady-state en time-resolved FRET-metingen beschreven om een bindingsplaats, waarvan de locatie niet bekend was, op een bestaande kristallografische structuur van het SecA-SecYEG-complex, belangrijke eiwitten in de algemene secretoire route 3 in kaart te^brengen.

De algemene secretoire route, een sterk geconserveerd systeem van prokaryoten tot eukaryoten tot archaea, bemiddelt het transport van eiwitten over of in het membraan naar hun functionele locatie in de cel. Voor Gram-negatieve bacteriën, zoals E. coli, het organisme dat in onze studie wordt gebruikt, worden eiwitten ingebracht in of getransloceerd over het binnenmembraan naar het periplasma. Het bacteriële SecY-kanaalcomplex (de translocon genoemd) coördineert met andere eiwitten om het nieuw gesynthetiseerde eiwit te transloceren, dat naar de juiste locatie in de cel wordt geleid via een signaalsequentie die zich meestal bevindt op de N-terminus^20,21. Voor eiwitten gebonden aan het periplasma, associeert het ATPase SecA-eiwit zich met de uitgangstunnel van het ribosoom en met het preproteïne nadat ongeveer 100 residuen zijn vertaald²². Samen met het SecB-chaperonne-eiwit houdt het het preproteïne in een ongevouwen toestand. SecA bindt aan de SecYEG-translocon en vergemakkelijkt door vele cycli van ATP-hydrolyse het eiwittransport over het membraan^23,24.

SecA is een multi-domein eiwit dat bestaat in cytosolische en membraangebonden vormen. SecA, een homodimeer eiwit in het cytosol, bestaat uit een preproteïnebindend of cross-linking domein²⁵, twee nucleotidebindende domeinen, een spiraalvormig vleugeldomein, een spiraalvormig steigerdomein en de twee helixvingers (THF)26,27,28,29 (figuur 1). In eerdere kristallografische studies van het SecA-SecYEG-complex suggereerde de locatie van de THF dat het actief betrokken was bij eiwittranslocatie en daaropvolgende cross-linking experimenten met het signaalpeptide stelden de betekenis van dit gebied in eiwittranslocatie verder vast^30,31. Eerdere studies, met behulp van de FRET-mappingmethodologie, toonden aan dat exogene signaalpeptiden binden aan dit gebied van SecA ^2,32. Om de conformatie en locatie van de signaalsequentie en het vroegrijpe gebied van het preproteïne volledig te begrijpen voorafgaand aan het inbrengen in het SecYEG-kanaal, werd een eiwitchimaera gemaakt waarin de signaalsequentie en residuen van het vroegrijpe gebied via een Ser-Gly-linker aan SecA werden bevestigd (figuur 1). Met behulp van dit biologisch levensvatbare construct werd verder aangetoond dat de signaalsequentie en het vroeg volwassen gebied van het preproteïne op een parallelle manier binden aan de THF². Vervolgens werd de FRET-mappingmethodologie gebruikt om de conformatie en locatie van de signaalsequentie en het vroege volwassen gebied in aanwezigheid van SecYEG op te helderen, zoals hieronder beschreven³.

Kennis van de 3D-structuur van het SecA-SecYEG-complex 33,34,35 en de mogelijke locatie van de bindingsplaats stelde ons in staat om oordeelkundig donor-acceptorlabels te plaatsen op locaties waar de kruising van individuele FRET-afstanden de bindingslocatie identificeert. Deze FRET-mappingmetingen onthulden dat de signaalsequentie en het vroege volwassen gebied van het preproteïne een haarspeld vormen met de punt aan de monding van het SecYEG-kanaal, wat aantoont dat de haarspeldstructuur wordt gesjabloond voorafgaand aan het inbrengen van het kanaal.