Förster 공명 에너지 전달 매핑: 글로벌 구조적 특징을 밝히기 위한 새로운 방법론

단백질의 경우, 3차원(3차원) 구조 지식과 함께 역학의 해명은, 생체분자 시스템의 구조-기능 관계에 대한 이해를 향상시킨다. X선 결정학 및 극저온 전자 현미경과 같은 구조적 방법은 정적 구조를 포착하고 종종 생체 분자 결합 및 역학의 측면을 밝히기 위해 여러 구조의 결정을 필요로합니다¹. 이 문서에서는 결합 부위 또는 결합 상호 작용과 같은 전역 구조 요소를 매핑하는 솔루션 기반 방법에 대해 설명합니다.이 요소는 잠재적으로 더 일시적이며 정적 방법에 의해 덜 쉽게 캡처됩니다. 이 방법론에 대한 강력한 후보 시스템은 3-D 구조가 이전에 X선 결정학, NMR 분광법 또는 기타 구조적 방법에 의해 결정된 시스템이다. 이 경우, 우리는 단백질 일반 분비 경로의 중심자인 SecA-SecYEG 복합체의 X선 결정 구조를 활용하여^{프리단백질을 멤}브레인을 가로지르는 수송 전에 Förster 공명 에너지 전달(FRET)을 사용하여 신호 펩티드 결합 부위의 위치를 매핑합니다. 3-D 구조에 대한 우리의 지식과 결합 된 유전 적 변형을 통한 생물학적 시스템의 조작은 채널 ³에 삽입되기 직전에 신호 서열 및 초기 성숙 영역의 입체 형태를 결정할 수있었습니다.

FRET는 공간 ^4,5를 통과하는 거리 의존적 방식으로 한 분자(공여체)로부터 다른 분자(수용체)로 에너지의 방사선 없는 전달을 포함한다. 이 전달의 효율은 공여체의 감소 또는 수용체 형광 강도의 증가를 통해 모니터링됩니다. 에너지 전달의 효율은 다음과 같이 설명 할 수 있습니다.

E = R0 6/(_R0⁶ +^R6)

여기서 R0 값은 전사가₅₀% 효율인 거리이다⁽⁶). 이 기술은 이전에 분자 통치자로서 기술되었으며, 공여체-수용체 염료 4,7,8,9의 동일성에 따라 2.5-12 nm 범위의 거리를 결정하는데 효과적이다. 공여체 형광 강도 및 수명은 수용체 유무에 관계없이 전달 효율의 결정을 허용하고 결과적으로 거리 ^5,8을 허용한다. 기술의 가용성, 방법의 감도 및 사용 편의성으로 인해 FRET는 단일 분자 형광 분광법 및 공초점 현미경⁶과 같은 분야에서 광범위한 적용을 발견했습니다. 녹색 형광 단백질과 같은 형광 단백질의 출현은 세포 내 역학 및 살아있는 세포 이미징의 관찰을 비교적 용이하게^10,11로 만들었다. 이와 같은 많은 FRET 응용 프로그램은이 가상 문제에서 자세히 설명합니다.

이 연구에서는 특히 FRET 측정을 사용하여 구조적 세부 사항을 결정하기 위해 거리 값을 산출하는 데 중점을 둡니다. 이전에는 FRET 측정이 단백질 12,13,14에 결합할 때 DNA 분자의 입체형태, 단백질의 내부 역학 및 단백질 결합 상호작용 ^15,16,17을 결정하는데 효과적으로 사용되었다. 이 방법의 장점은 상대적으로 적은 양의 재료를 가진 솔루션에서 유연하고 역동적 인 구조 요소를 결정할 수있는 능력에 있습니다. 중요한 것은이 방법이 기존 구조 정보와 함께 사용될 때 특히 효과적이며 3-D 구조 결정 수단으로 사용할 수 없다는 것입니다. 이 방법은 작업이 종종 계산 시뮬레이션^18,19와 결합 된 기존 구조 정보를 기반으로하는 경우 구조의 최상의 통찰력과 구체화^를 제공합니다. 여기서, 정상 상태 및 시간-분해능 FRET 측정으로부터 수득된 거리의 사용은 일반적인 분비 경로에서 SecA-SecYEG 복합체의 기존 결정학적 구조 상에서, 주요 단백질의 위치를 알려지지 않았던 결합 부위를 맵핑하기 위해 기술된다³.

원핵생물에서 진핵생물, 고세균에 이르기까지 고도로 보존된 시스템인 일반 분비 경로는 단백질을 세포에서 기능적 위치로 또는 막으로 운반하는 것을 매개합니다. 우리의 연구에 사용 된 유기체 인 대장균과 같은 그람 음성 박테리아의 경우 단백질은 내막을 가로 질러 주변 세포로 삽입되거나 전좌됩니다. 박테리아 SecY 채널 복합체 (트랜스로콘이라고 함)는 새로 합성 된 단백질을 전좌시키기 위해 다른 단백질과 협조하며, 이는 일반적으로 N 말단^20,21에 위치한 신호 서열을 통해 세포 내의 정확한 위치로 향합니다. 주변형질에 결합된 단백질의 경우, ATPase SecA 단백질은 리보솜의 출구 터널과 연관되고, 약 100개의 잔기가 번역된 후 프리단백질과 연관된다⁽²²). SecB 샤페론 단백질과 함께, 프리단백질을 펼쳐진 상태로 유지한다. SecA는 SecYEG 트랜스로콘에 결합하고, ATP 가수분해의 많은 사이클을 통해, 막^(23,24)을 가로지르는 단백질 수송을 용이하게 한다.

SecA는 세포질 및 막 결합 형태로 존재하는 다중 도메인 단백질이다. 시토졸 내의 동종이량체 단백질로서, SecA는 프리단백질 결합 또는 가교 도메인²⁵, 2개의 뉴클레오티드-결합 도메인, 나선형 날개 도메인, 나선형 스캐폴드 도메인, 및 2개의 나선 손가락(THF)^26,27,28,29로 구성된다(도 1). SecA-SecYEG 복합체의 이전의 결정학적 연구에서, THF의 위치는 단백질 전좌 및 신호 펩티드를 사용한 후속 가교 실험에 적극적으로 관여하였음을 시사하였고, 단백질 전좌^30,31에서 이 영역의 중요성을 더욱 확립하였다. FRET 매핑 방법론을 사용한 이전의 연구들은 외인성 신호 펩티드가 SecA^2,32의 이 영역에 결합한다는 것을 입증하였다. SecYEG 채널 내로 삽입하기 전에 예비단백질의 신호 서열 및 초기 성숙 영역의 입체 형태 및 위치를 완전히 이해하기 위해, 초기 성숙 영역의 신호 서열 및 잔기가 Ser-Gly 링커를 통해 SecA에 부착되는 단백질 키메라가 생성되었다(도 1). 이러한 생물학적으로 실행 가능한 구축물을 사용하여, 예비단백질의 신호 서열 및 초기 성숙 영역이 병렬 방식으로 THF에 결합한다는 것을 추가로 입증하였다². 이어서, FRET 매핑 방법론을^{사용하여 후술}하는 바와 같이 SecYEG의 존재 하에 신호 서열 및 초기 성숙 영역의 입체 형태 및 위치를 밝히기 위해 사용되었다.

SecA-SecYEG 복합체^33,34,35의 ^3-D 구조와 결합 부위의 가능한 위치에 대한 지식을 통해 개별 FRET 거리의 교차점이 결합 부위 위치를 식별하는 위치에 기증자 – 수용체 라벨을 신중하게 배치 할 수있었습니다. 이러한 FRET 매핑 측정은 프리단백질의 신호 서열 및 초기 성숙 영역이 SecYEG 채널의 입에 위치한 팁과 함께 헤어핀을 형성한다는 것을 밝혀내고, 헤어핀 구조가 채널 삽입 전에 템플리트된다는 것을 입증한다.