Summary

Una plataforma flexible para monitorear el aprendizaje asociativo sensorial dependiente del cerebelo

Published: January 19, 2022
doi:

Summary

Hemos desarrollado una plataforma única para rastrear el comportamiento animal durante dos tareas de aprendizaje asociativo dependientes de la fibra de escalada. El diseño de bajo costo permite la integración con experimentos optogenéticos o de imágenes dirigidos a la actividad cerebelosa asociada a la fibra de escalada.

Abstract

La escalada de entradas de fibra a las células de Purkinje proporciona señales instructivas críticas para el aprendizaje asociativo dependiente del cerebelo. El estudio de estas señales en ratones con cabeza fija facilita el uso de métodos de imagen, electrofisiológicos y optogenéticos. Aquí, se desarrolló una plataforma de comportamiento de bajo costo (~ $ 1000) que permite el seguimiento del aprendizaje asociativo en ratones con cabeza fija que se vuelven libremente en una rueda de carrera. La plataforma incorpora dos paradigmas comunes de aprendizaje asociativo: el acondicionamiento del parpadeo ocular y el acondicionamiento de sobresalto táctil retardado. El comportamiento se rastrea utilizando una cámara y el movimiento de la rueda por un detector. Describimos los componentes y la configuración y proporcionamos un protocolo detallado para la capacitación y el análisis de datos. Esta plataforma permite la incorporación de estimulación optogenética e imagen de fluorescencia. El diseño permite que una sola computadora host controle múltiples plataformas para entrenar a múltiples animales simultáneamente.

Introduction

El condicionamiento pavloviano de la asociación subsegundo entre estímulos para provocar una respuesta condicionada se ha utilizado durante mucho tiempo para sondear el aprendizaje dependiente del cerebelo. Por ejemplo, en el acondicionamiento clásico de retardo del parpadeo ocular (DEC), los animales aprenden a hacer un parpadeo protector bien oportuno en respuesta a un estímulo condicional neutro (CS; por ejemplo, un destello de luz o tono auditivo) cuando se combina repetidamente con un estímulo incondicional (US; por ejemplo, una bocanada de aire aplicada a la córnea) que siempre provoca un parpadeo reflejo, y que llega al final o cerca del final del CS. La respuesta aprendida se conoce como respuesta condicionada (RC), mientras que la respuesta refleja se conoce como respuesta incondicionada (UR). En conejos, las lesiones específicas del cerebelo interrumpen esta forma de aprendizaje 1,2,3,4. Además, los picos complejos celulares de Purkinje, impulsados por sus entradas de fibra ascendente5, proporcionan una señal necesaria de 6,7 y 8,9 suficiente para la adquisición de CR correctamente sincronizados.

Más recientemente, se han desarrollado paradigmas de aprendizaje asociativo dependientes de la fibra para ratones con cabeza fija. DEC fue el primer paradigma de aprendizaje asociativo que se adaptó a esta configuración10,11. El DEC en ratones fijos de cabeza se ha utilizado para identificar regiones cerebelosas 11,12,13,14,15,16,17 y elementos de circuito 11,1 2,13,14,15,18,19 que son necesarios para la adquisición y extinción de tareas. Este enfoque también se ha utilizado para demostrar cómo evoluciona la representación fisiológica a nivel celular de los parámetros de la tarea con el aprendizaje 13,15,16.

Además del parpadeo ocular, el paradigma del acondicionamiento táctil de sobresalto retardado (DTSC) se desarrolló recientemente como una novedosa tarea de aprendizaje asociativo para ratones con cabeza fija20. Conceptualmente similar al DEC, DTSC implica la presentación de un CS neutro con un US, un toque en la cara suficiente en intensidad para activar un reflejo de sobresalto21,22 como el UR. En el paradigma DTSC, tanto el UR como el CR se leen como locomoción hacia atrás en una rueda. DTSC ahora se ha utilizado para descubrir cómo el aprendizaje asociativo altera la actividad cerebelosa y los patrones de expresión génica20.

En este trabajo, se desarrolló un método para aplicar de manera flexible DEC o DTSC en una sola plataforma. Los atributos de estímulo y plataforma se esquematizan en la Figura 1. El diseño incorpora la capacidad de rastrear el comportamiento de los animales con una cámara, así como un codificador giratorio para rastrear la locomoción del mouse en una rueda. Todos los aspectos del registro de datos y la estructura de prueba están controlados por microcontroladores emparejados (Arduino) y una computadora de placa única (SBC; Raspberry Pi). Se puede acceder a estos dispositivos a través de una interfaz gráfica de usuario proporcionada. Aquí, presentamos un flujo de trabajo para la configuración, preparación y ejecución de experimentos, y una canalización de análisis personalizada para la visualización de datos.

Protocol

Los protocolos de animales descritos aquí han sido aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Princeton. 1. Configuración del SBC Conecte el cable de interfaz serie de la cámara (CSI) a la cámara Raspberry NoIR V2 y al puerto de la cámara en el SBC. Descargue el sistema operativo del SBC en el equipo host. Escriba la imagen del sistema operativo en una tarjeta digital micro segura (microSD).NOTA: Las instrucciones …

Representative Results

Flujo de trabajo para experimentos y análisis DECLa selección adecuada de parámetros experimentales es importante para el entrenamiento exitoso de acondicionamiento de parpadeo ocular retardado (DEC). Para los datos presentados aquí, se utilizó la GUI para elegir una duración de CS de 350 ms y una duración de US de 50 ms. Este emparejamiento da como resultado un intervalo entre estímulos de 300 ms: lo suficientemente largo como para evitar la producción de RC de baja amplitud<sup class="xref…

Discussion

La plataforma con protocolos asociados descritos aquí se puede utilizar para rastrear de manera confiable el comportamiento animal en dos tareas de aprendizaje asociativo sensorial. Cada tarea depende de la comunicación intacta a través de la vía de la fibra de escalada. En el diseño descrito aquí, incorporamos elementos para facilitar el aprendizaje y el registro / perturbación de la respuesta cerebelosa. Estos incluyen una rueda para permitir la locomoción libre11,18<sup class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo está respaldado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud Mental NRSA F32 MH120887-03 (a G.J.B.) y R01 NS045193 y R01 MH115750 (a S.S-H.W.). Agradecemos a los Dres. Bas Koekkoek y Henk-Jan Boele por las útiles discusiones para optimizar la configuración de DEC y a los Dres. Yue Wang y Xiaoying Chen por las útiles discusiones para optimizar la configuración de DTSC.

Materials

"B" Quick Base For C&B METABOND – 10 mL bottle Parkell S398 Dental cement solvent
"C" Universal TBB Catalyst – 0.7 mL Parkell S371 Catalyst
#8 Washers Thorlabs W8S038 Washers
0.250" (1/4") x 8.00" Stainless Steel Precision Shafting Servocity 634172 1/4" shaft
0.250” (0.770") Clamping Hub Servocity 545588 Clamping hub
1/4" to 6 mm Set Screw Shaft Coupler- 5 pack Actobotics 625106 Shaft-coupling sleeve
1/4"-20 Cap Screws, 3/4" Long Thorlabs SH25S075 1/4" bolt
100 pcs 5 mm 395–400 nm UV Ultraviolet LED Light Emitting Diode Clear Round Lens 29 mm Long Lead (DC 3V) LEDs Lights +100 pcs Resistors EDGELEC ‎ED_YT05_U_100Pcs CS LEDs
2 m Micro HDMI to DVI-D Cable – M/M – 2 m Micro HDMI to DVI Cable – 19 pin HDMI (D) Male to DVI-D Male – 1920 x 1200 Video Star-tech ‎HDDDVIMM2M Raspberry Pi4B to monitor cable
256 GB Ultra Fit USB 3.1 Flash Drive SanDisk ‎SDCZ430-256G-G46 USB thumb drive
3.3 V–5 V 4 Channels Logic Level Converter Bi-Directional Shifter Module Amazon B00ZC6B8VM Logic level shifter
32 GB 95 MB/s (U1) microSDHC EVO Select Memory Card Samsung ‎MB-ME32GA/AM microSD card
4.50" Aluminum Channel Servocity 585444 4.5" aluminum channel
48-LED CCTV Ir Infrared Night Vision Illuminator Towallmark SODIAL Infrared light array
4PCS Breadboards Kit Include 2PCS 830 Point 2PCS 400 Point Solderless Breadboards for Proto Shield Distribution Connecting Blocks REXQualis B07DL13RZH Breadboard
5 Port Gigabit Unmanaged Ethernet Network Switch TP-Link ‎TL-SG105 Ethernet switch
5 V 2.5 A Raspberry Pi 3 B+ Power Supply/Adapter Canakit ‎DCAR-RSP-2A5 Power supply for Raspberry Pi 3B+
5-0 ETHILON BLACK 1 x 18" C-3 Ethicon 668G Sutures
6 mm Shaft Encoder 2000 PPR Pushpull Line Driver Universal Output Line Driver Output 5-26 V dc Supply Calt  B01EWER68I Rotary encoder
Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 1", 5 Pack Thorlabs TR1-P5 Optical posts
Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack Thorlabs TR2-P5 Optical posts
Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 4", 5 Pack Thorlabs TR4-P5 Optical posts
Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 6", 5 Pack Thorlabs TR6-P5 Optical posts
Ø1/2" Post Holder, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 2" Thorlabs PH2 Optical post holder
Adapter-062-M X LUER LOCK-F The Lee Co. TMRA3201950Z Solenoid valve luer adapter
Aeromat Foam Roller Size: 36" Length Aeromat B002H3CMUE Foam roller
Aluminum Breadboard 10" x 12" x 1/2", 1/4"-20 Taps Thorlabs MB1012 Aluminum breadboard
Amazon Basics HDMI to DVI Adapter Cable, Black, 6 Feet, 1-Pack Amazon HL-007347 Raspberry Pi3B+ to monitor cable
Arduino  Uno R3 Arduino A000066 Arduino Uno (microcontroller board)
Arduino Due Arduino ‎A000062 Arduino Due (microcontroller board)
Bench Power Supply, Single, Adjustable, 3 Output, 0 V, 24 V, 0 A, 2 A Tenma 72-8335A Power supply
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet, 12" x 24" x 1/8" McMaster Carr 8560K257 Acrylic sheet
CNC Stepper Motor Driver 1.0–4.2 A 20–50 V DC 1/128 Micro-Step Resolutions for Nema 17 and 23 Stepper Motor Stepper Online B06Y5VPSFN Stepper motor driver
Compact Compressed Air Regulator, Inline Relieving, Brass Housing, 1/4 NPT McMaster Carr 6763K13 Air source regulator
Cotton Swab Puritan 806-WC Cotton swab
Dell 1908FP 19" Flat Panel Monitor – 1908FPC Dell 1908FPC Computer monitor
Flex Cable for Raspberry Pi Camera Adafruit 2144 camera serial interface cable
High Torque Nema 17 Bipolar Stepper Motor 92 oz·in/65 N·cm 2.1 A Extruder Motor Stepper Online 17HS24-2104S Stepper motor
Isoflurane Henry Schein 66794001725 Isoflurane
Krazy Maximum Bond Permanent Glue, 0.18 oz. Krazy Glue KG483 Cyanoacrylate glue
Lidocaine HCl VetOne 510212 Lidocaine
Low-Strength Steel Hex Nut, Grade 2, Zinc-Plated, 1/4"-20 Thread Size McMaster Carr 90473A029 Nuts
M3 x 50 mm Partially Threaded Hex Key Socket Cap Head Screws 10 pcs Uxcell A16040100ux1380 M3 bolt
NEMA 17 Stepper Motor Mount ACTOBOTICS 555152 Stepper motor mount
Official Raspberry Pi Power Supply 5.1 V 3 A with USB C – 1.5 m long Adafruit 4298 Power supply for Raspberry Pi 4B
Optixcare Dog & Cat Eye Lube Lubricating Gel, 0.70-oz tube Optixcare 142422 Opthalimic ointment
Precision Stainless Steel Ball Bearing, Shielded, Trade No. R188-2Z, 13000 rpm Maximum Speed McMaster-Carr 3759T57 Bearing
Premium Female/Female Jumper Wires – 40 x 6" Adafruit 266 Wires
Premium Female/Male 'Extension' Jumper Wires – 40 x 6" (150 mm) Adafruit 826 Wires
Premium Male/Male Jumper Wires – 40 x 6" Adafruit 758 Wires
Radiopaque L-Powder for C&B METABOND – 5 g Parkell S396 Dental cement powder
Raspberry Pi (3B+ or 4B) Adafruit 3775 or 4295 Raspberry Pi
Raspberry Pi NoIR Camera Module V2 – 8MP 1080P30 Raspberry Pi Foundation RPI3-NOIR-V2 Raspberry NoIR V2 camera
Right-Angle Bracket, 1/4" (M6) Counterbored Slot, 8-32 Taps Thorlabs AB90E Right-angle bracket
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 3/16" Hex Thorlabs RA90 Right-angle optical post clamp
Right-Angle End Clamp for Ø1/2" Posts, 1/4"-20 Stud and 3/16" Hex Thorlabs RA180 Right-angle end clamp
RJ45 Cat-6 Ethernet Patch Internet Cable Amazon ‎CAT6-7FT-5P-BLUE Ethernet cable
Rotating Clamp for Ø1/2" Posts, 360° Continuously Adjustable, 3/16" Hex Thorlabs SWC Rotating optical post clamps
Spike & Hold Driver-0.1 TO 5 MS The Lee Co. IECX0501350A Solenoid valve driver
Swivel Base Adapter Thorlabs UPHA Post holder adapter
USB 2.0 A-Male to Micro B Cable, 6 feet Amazon ‎7T9MV4 USB2 type A to USB2 micro cable
USB 2.0 Printer Cable – A-Male to B-Male, 6 Feet (1.8 m) Amazon B072L34SZS USB2 type B to USB2 type A cable
VHS-M/SP-12 V The Lee Co. INKX0514900A Solenoid valve
Zinc-Plated Steel 1/4" washer, OD 1.000" McMaster Carr 91090A108 Washers

References

  1. McCormick, D. A., Lavond, D. G., Clark, G. A., Kettner, R. E., Rising, C. E., Thompson, R. F. The engram found? Role of the cerebellum in classical conditioning of nictitating membrane and eyelid responses. Bulletin of the Psychonomic Society. 18 (3), 103-105 (1981).
  2. McCormick, D. A., Clark, G. A., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Initial localization of the memory trace for a basic form of learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (8), 2731-2735 (1982).
  3. McCormick, D. A., Thompson, R. F. Cerebellum: essential involvement in the classically conditioned eyelid response. Science. 223 (4633), 296-299 (1984).
  4. Krupa, D. J., Thompson, J. K., Thompson, R. F. Localization of a memory trace in the mammalian brain. Science. 260 (5110), 989-991 (1993).
  5. Llinás, R., Sugimori, M. Electrophysiological properties of in vitro Purkinje cell dendrites in mammalian cerebellar slices. The Journal of Physiology. 305, 197-213 (1980).
  6. Mintz, M., Lavond, D. G., Zhang, A. A., Yun, Y., Thompson, R. F. Unilateral inferior olive NMDA lesion leads to unilateral deficit in acquisition and retention of eyelid classical conditioning. Behavioral and Neural Biology. 61 (3), 218-224 (1994).
  7. Welsh, J. P., Harvey, J. A. Cerebellar lesions and the nictitating membrane reflex: performance deficits of the conditioned and unconditioned response. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 9 (1), 299-311 (1989).
  8. Mauk, M. D., Steinmetz, J. E., Thompson, R. F. Classical conditioning using stimulation of the inferior olive as the unconditioned stimulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (14), 5349-5353 (1986).
  9. Steinmetz, J. E., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Classical conditioning in rabbits using pontine nucleus stimulation as a conditioned stimulus and inferior olive stimulation as an unconditioned stimulus. Synapse. 3 (3), 225-233 (1989).
  10. Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Adaptive timing of motor output in the mouse: The role of movement oscillations in eyelid conditioning. Frontiers in Integrative Neuroscience. 5, 72 (2011).
  11. Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Cerebellar-dependent expression of motor learning during eyeblink conditioning in head-fixed mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14845-14853 (2014).
  12. Heiney, S. A., Kim, J., Augustine, G. J., Medina, J. F. Precise control of movement kinematics by optogenetic inhibition of purkinje cell activity. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2321-2330 (2014).
  13. Ten Brinke, M. M., et al. Evolving models of pavlovian conditioning: Cerebellar cortical dynamics in awake behaving mice. Cell Reports. 13 (9), 1977-1988 (2015).
  14. Gao, Z., et al. Excitatory cerebellar nucleocortical circuit provides internal amplification during associative conditioning. Neuron. 89 (3), 645-657 (2016).
  15. Giovannucci, A., et al. Cerebellar granule cells acquire a widespread predictive feedback signal during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (5), 727-734 (2017).
  16. Ten Brinke, M. M., et al. Dynamic modulation of activity in cerebellar nuclei neurons during pavlovian eyeblink conditioning in mice. eLife. 6, 28132 (2017).
  17. Wang, X., Yu, S., Ren, Z., De Zeeuw, C. I., Gao, Z. A FN-MdV pathway and its role in cerebellar multimodular control of sensorimotor behavior. Nature Communications. 11 (1), 6050 (2020).
  18. Albergaria, C., Silva, N. T., Pritchett, D. L., Carey, M. R. Locomotor activity modulates associative learning in mouse cerebellum. Nature Neuroscience. 21 (5), 725-735 (2018).
  19. Kim, O. A., Ohmae, S., Medina, J. F. A cerebello-olivary signal for negative prediction error is sufficient to cause extinction of associative motor learning. Nature Neuroscience. 23 (12), 1550-1554 (2020).
  20. Yamada, T., et al. Sensory experience remodels genome architecture in neural circuit to drive motor learning. Nature. 569 (7758), 708-713 (2019).
  21. Horlington, M. Startle response circadian rhythm in rats: lack of correlation with motor activity. Physiology & Behavior. 5 (1), 49-53 (1970).
  22. Yeomans, J. S., Li, L., Scott, B. W., Frankland, P. W. Tactile, acoustic and vestibular systems sum to elicit the startle reflex. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 26 (1), 1-11 (2002).
  23. . Raspberry Pi Operating system images Available from: https://www.raspberrypi.com/software/operationg-systems/ (2021)
  24. . VNC Server. VNC® Connect Available from: https://www.realvnc.com/en/connect/download/vnc/ (2021)
  25. . Anaconda: The world’s most popular data science platform Available from: https://xddebuganaconda.xdlab.co/ (2021)
  26. De Zeeuw, C. I., Ten Brinke, M. M. Motor learning and the cerebellum. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 021683 (2015).
  27. Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
  28. Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique. Journal of Neurophysiology. 88 (4), 2124-2133 (2002).
  29. Kloth, A. D., et al. Cerebellar associative sensory learning defects in five mouse autism models. eLife. 4, 06085 (2015).
  30. Boele, H. -. J., Koekkoek, S. K. E., De Zeeuw, C. I. Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 3, (2010).
  31. Lin, C., Disterhoft, J., Weiss, C. Whisker-signaled eyeblink classical conditioning in head-fixed Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53310 (2016).
  32. Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
  33. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).

Play Video

Cite This Article
Broussard, G. J., Kislin, M., Jung, C., Wang, S. S. -. A Flexible Platform for Monitoring Cerebellum-Dependent Sensory Associative Learning. J. Vis. Exp. (179), e63205, doi:10.3791/63205 (2022).

View Video