Eine flexible Plattform zur Überwachung des kleinhirnabhängigen sensorischen assoziativen Lernens
Summary
Wir haben eine einzige Plattform entwickelt, um das Verhalten von Tieren während zweier kletterfaserabhängiger assoziativer Lernaufgaben zu verfolgen. Das kostengünstige Design ermöglicht die Integration mit optogenetischen oder bildgebenden Experimenten, die auf das Klettern der faserassoziierten Kleinhirnaktivität gerichtet sind.
Abstract
Kletterfasereingänge zu Purkinje-Zellen liefern lehrreiche Signale, die für das kleinhirnabhängige assoziative Lernen entscheidend sind. Die Untersuchung dieser Signale an kopffixierten Mäusen erleichtert den Einsatz von bildgebenden, elektrophysiologischen und optogenetischen Methoden. Hier wurde eine kostengünstige Verhaltensplattform (~ $ 1000) entwickelt, die die Verfolgung des assoziativen Lernens in kopffesten Mäusen ermöglicht, die sich frei auf einem laufenden Rad befinden. Die Plattform umfasst zwei gängige assoziative Lernparadigmen: Augenzwinkernkonditionierung und verzögerte taktile Schreckkonditionierung. Das Verhalten wird mit einer Kamera und die Radbewegung von einem Detektor verfolgt. Wir beschreiben die Komponenten und den Aufbau und stellen ein detailliertes Protokoll für Training und Datenanalyse zur Verfügung. Diese Plattform ermöglicht die Integration von optogenetischer Stimulation und Fluoreszenzbildgebung. Das Design ermöglicht es einem einzelnen Host-Computer, mehrere Plattformen für das gleichzeitige Training mehrerer Tiere zu steuern.
Introduction
Die pawlowsche Konditionierung der Subsekundenassoziation zwischen Reizen, um eine konditionierte Reaktion hervorzurufen, wird seit langem verwendet, um das kleinhirnabhängige Lernen zu untersuchen. Zum Beispiel lernen Tiere bei der klassischen verzögerten Augenblinzelung (DEC), als Reaktion auf einen neutralen bedingten Reiz (CS; z. B. ein Lichtblitz oder einen auditiven Ton) ein gut getimtes schützendes Blinzeln zu machen, wenn es wiederholt mit einem bedingungslosen Reiz (US; z. B. einem Luftstoß auf die Hornhaut) gepaart wird, der immer ein Reflexblinzeln hervorruft. und die am oder nahe dem Ende des CS kommt. Die erlernte Reaktion wird als konditionierte Reaktion (CR) bezeichnet, während die Reflexantwort als unkonditionierte Antwort (UR) bezeichnet wird. Bei Kaninchen stören kleinhirnspezifische Läsionen diese Form des Lernens 1,2,3,4. Darüber hinaus liefern Purkinje-Zellkomplexspitzen, angetrieben durch ihre Kletterfasereingänge5, ein notwendiges6,7– und ausreichendes 8,9-Signal für die Erfassung von richtig getimten CRs.
In jüngerer Zeit wurden klimmfaserabhängige assoziative Lernparadigmen für kopffixierte Mäuse entwickelt. DEC war das erste assoziative Lernparadigma, das an diese Konfiguration angepasstwurde 10,11. DEC in kopffixierten Mäusen wurde verwendet, um Kleinhirnregionen 11,12,13,14,15,16,17 und Schaltungselemente 11,1 2,13,14,15,18,19 zu identifizieren die für die Aufgabenerfassung und das Löschen erforderlich sind. Dieser Ansatz wurde auch verwendet, um zu demonstrieren, wie sich die physiologische Darstellung von Aufgabenparametern auf zellulärer Ebene mit dem Lernen von 13,15,16 entwickelt.
Zusätzlich zum Augenblinzeln wurde kürzlich das DTSC-Paradigma (Delayed Startle Tactile Conditioning) als neuartige assoziative Lernaufgabe für kopffeste Mäuse20 entwickelt. Konzeptionell ähnlich wie DEC, beinhaltet DTSC die Präsentation eines neutralen CS mit einem US, einem Klopfen auf das Gesicht, das in der Intensität ausreicht, um einen Schreckreflex21,22 als UR zu aktivieren. Im DTSC-Paradigma werden sowohl die UR als auch die CR als rückwärts gerichtete Fortbewegung auf einem Rad ausgelesen. DTSC wurde nun verwendet, um aufzudecken, wie assoziatives Lernen die Kleinhirnaktivität und die Muster der Genexpressionverändert 20.
In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, um DEC oder DTSC flexibel in einer einzigen Plattform anzuwenden. Die Stimulus- und Plattformattribute sind in Abbildung 1 schematisiert. Das Design umfasst die Fähigkeit, das Verhalten von Tieren mit einer Kamera zu verfolgen, sowie einen Drehgeber, um die Fortbewegung der Maus auf einem Rad zu verfolgen. Alle Aspekte der Datenprotokollierung und der Versuchsstruktur werden von gepaarten Mikrocontrollern (Arduino) und einem Einplatinencomputer (SBC; Raspberry Pi). Auf diese Geräte kann über eine bereitgestellte grafische Benutzeroberfläche zugegriffen werden. Hier stellen wir einen Workflow für den Aufbau, die Versuchsvorbereitung und -durchführung sowie eine maßgeschneiderte Analysepipeline für die Datenvisualisierung vor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier skizzierte Plattform mit zugehörigen Protokollen kann verwendet werden, um das Verhalten von Tieren in zwei sensorisch assoziativen Lernaufgaben zuverlässig zu verfolgen. Jede Aufgabe hängt von einer intakten Kommunikation über den Kletterfaserweg ab. In das hier beschriebene Design integrieren wir Elemente, die das Lernen und die Aufzeichnung / Störung der Kleinhirnreaktion erleichtern. Dazu gehört ein Rad, das eine freie Fortbewegung11,18 sowie e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird durch Zuschüsse der National Institutes of Mental Health NRSA F32 MH120887-03 (an G.J.B.) und R01 NS045193 und R01 MH115750 (an S.S-H.W.) unterstützt. Wir danken Dr. Bas Koekkoek und Dr. Henk-Jan Boele für hilfreiche Gespräche zur Optimierung des DEC-Setups und Dr. Yue Wang und Dr. Xiaoying Chen für hilfreiche Gespräche zur Optimierung des DTSC-Setups.
Materials
| "B" Quick Base For C&B METABOND – 10 mL bottle | Parkell | S398 | Dental cement solvent |
| "C" Universal TBB Catalyst – 0.7 mL | Parkell | S371 | Catalyst |
| #8 Washers | Thorlabs | W8S038 | Washers |
| 0.250" (1/4") x 8.00" Stainless Steel Precision Shafting | Servocity | 634172 | 1/4" shaft |
| 0.250” (0.770") Clamping Hub | Servocity | 545588 | Clamping hub |
| 1/4" to 6 mm Set Screw Shaft Coupler- 5 pack | Actobotics | 625106 | Shaft-coupling sleeve |
| 1/4"-20 Cap Screws, 3/4" Long | Thorlabs | SH25S075 | 1/4" bolt |
| 100 pcs 5 mm 395–400 nm UV Ultraviolet LED Light Emitting Diode Clear Round Lens 29 mm Long Lead (DC 3V) LEDs Lights +100 pcs Resistors | EDGELEC | ED_YT05_U_100Pcs | CS LEDs |
| 2 m Micro HDMI to DVI-D Cable – M/M – 2 m Micro HDMI to DVI Cable – 19 pin HDMI (D) Male to DVI-D Male – 1920 x 1200 Video | Star-tech | HDDDVIMM2M | Raspberry Pi4B to monitor cable |
| 256 GB Ultra Fit USB 3.1 Flash Drive | SanDisk | SDCZ430-256G-G46 | USB thumb drive |
| 3.3 V–5 V 4 Channels Logic Level Converter Bi-Directional Shifter Module | Amazon | B00ZC6B8VM | Logic level shifter |
| 32 GB 95 MB/s (U1) microSDHC EVO Select Memory Card | Samsung | MB-ME32GA/AM | microSD card |
| 4.50" Aluminum Channel | Servocity | 585444 | 4.5" aluminum channel |
| 48-LED CCTV Ir Infrared Night Vision Illuminator | Towallmark | SODIAL | Infrared light array |
| 4PCS Breadboards Kit Include 2PCS 830 Point 2PCS 400 Point Solderless Breadboards for Proto Shield Distribution Connecting Blocks | REXQualis | B07DL13RZH | Breadboard |
| 5 Port Gigabit Unmanaged Ethernet Network Switch | TP-Link | TL-SG105 | Ethernet switch |
| 5 V 2.5 A Raspberry Pi 3 B+ Power Supply/Adapter | Canakit | DCAR-RSP-2A5 | Power supply for Raspberry Pi 3B+ |
| 5-0 ETHILON BLACK 1 x 18" C-3 | Ethicon | 668G | Sutures |
| 6 mm Shaft Encoder 2000 PPR Pushpull Line Driver Universal Output Line Driver Output 5-26 V dc Supply | Calt | B01EWER68I | Rotary encoder |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 1", 5 Pack | Thorlabs | TR1-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | Thorlabs | TR2-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 4", 5 Pack | Thorlabs | TR4-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 6", 5 Pack | Thorlabs | TR6-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Post Holder, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 2" | Thorlabs | PH2 | Optical post holder |
| Adapter-062-M X LUER LOCK-F | The Lee Co. | TMRA3201950Z | Solenoid valve luer adapter |
| Aeromat Foam Roller Size: 36" Length | Aeromat | B002H3CMUE | Foam roller |
| Aluminum Breadboard 10" x 12" x 1/2", 1/4"-20 Taps | Thorlabs | MB1012 | Aluminum breadboard |
| Amazon Basics HDMI to DVI Adapter Cable, Black, 6 Feet, 1-Pack | Amazon | HL-007347 | Raspberry Pi3B+ to monitor cable |
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | Arduino Uno (microcontroller board) |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Arduino Due (microcontroller board) |
| Bench Power Supply, Single, Adjustable, 3 Output, 0 V, 24 V, 0 A, 2 A | Tenma | 72-8335A | Power supply |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet, 12" x 24" x 1/8" | McMaster Carr | 8560K257 | Acrylic sheet |
| CNC Stepper Motor Driver 1.0–4.2 A 20–50 V DC 1/128 Micro-Step Resolutions for Nema 17 and 23 Stepper Motor | Stepper Online | B06Y5VPSFN | Stepper motor driver |
| Compact Compressed Air Regulator, Inline Relieving, Brass Housing, 1/4 NPT | McMaster Carr | 6763K13 | Air source regulator |
| Cotton Swab | Puritan | 806-WC | Cotton swab |
| Dell 1908FP 19" Flat Panel Monitor – 1908FPC | Dell | 1908FPC | Computer monitor |
| Flex Cable for Raspberry Pi Camera | Adafruit | 2144 | camera serial interface cable |
| High Torque Nema 17 Bipolar Stepper Motor 92 oz·in/65 N·cm 2.1 A Extruder Motor | Stepper Online | 17HS24-2104S | Stepper motor |
| Isoflurane | Henry Schein | 66794001725 | Isoflurane |
| Krazy Maximum Bond Permanent Glue, 0.18 oz. | Krazy Glue | KG483 | Cyanoacrylate glue |
| Lidocaine HCl | VetOne | 510212 | Lidocaine |
| Low-Strength Steel Hex Nut, Grade 2, Zinc-Plated, 1/4"-20 Thread Size | McMaster Carr | 90473A029 | Nuts |
| M3 x 50 mm Partially Threaded Hex Key Socket Cap Head Screws 10 pcs | Uxcell | A16040100ux1380 | M3 bolt |
| NEMA 17 Stepper Motor Mount | ACTOBOTICS | 555152 | Stepper motor mount |
| Official Raspberry Pi Power Supply 5.1 V 3 A with USB C – 1.5 m long | Adafruit | 4298 | Power supply for Raspberry Pi 4B |
| Optixcare Dog & Cat Eye Lube Lubricating Gel, 0.70-oz tube | Optixcare | 142422 | Opthalimic ointment |
| Precision Stainless Steel Ball Bearing, Shielded, Trade No. R188-2Z, 13000 rpm Maximum Speed | McMaster-Carr | 3759T57 | Bearing |
| Premium Female/Female Jumper Wires – 40 x 6" | Adafruit | 266 | Wires |
| Premium Female/Male 'Extension' Jumper Wires – 40 x 6" (150 mm) | Adafruit | 826 | Wires |
| Premium Male/Male Jumper Wires – 40 x 6" | Adafruit | 758 | Wires |
| Radiopaque L-Powder for C&B METABOND – 5 g | Parkell | S396 | Dental cement powder |
| Raspberry Pi (3B+ or 4B) | Adafruit | 3775 or 4295 | Raspberry Pi |
| Raspberry Pi NoIR Camera Module V2 – 8MP 1080P30 | Raspberry Pi Foundation | RPI3-NOIR-V2 | Raspberry NoIR V2 camera |
| Right-Angle Bracket, 1/4" (M6) Counterbored Slot, 8-32 Taps | Thorlabs | AB90E | Right-angle bracket |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 3/16" Hex | Thorlabs | RA90 | Right-angle optical post clamp |
| Right-Angle End Clamp for Ø1/2" Posts, 1/4"-20 Stud and 3/16" Hex | Thorlabs | RA180 | Right-angle end clamp |
| RJ45 Cat-6 Ethernet Patch Internet Cable | Amazon | CAT6-7FT-5P-BLUE | Ethernet cable |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Posts, 360° Continuously Adjustable, 3/16" Hex | Thorlabs | SWC | Rotating optical post clamps |
| Spike & Hold Driver-0.1 TO 5 MS | The Lee Co. | IECX0501350A | Solenoid valve driver |
| Swivel Base Adapter | Thorlabs | UPHA | Post holder adapter |
| USB 2.0 A-Male to Micro B Cable, 6 feet | Amazon | 7T9MV4 | USB2 type A to USB2 micro cable |
| USB 2.0 Printer Cable – A-Male to B-Male, 6 Feet (1.8 m) | Amazon | B072L34SZS | USB2 type B to USB2 type A cable |
| VHS-M/SP-12 V | The Lee Co. | INKX0514900A | Solenoid valve |
| Zinc-Plated Steel 1/4" washer, OD 1.000" | McMaster Carr | 91090A108 | Washers |
References
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