Summary

Ex Vivo Perfusione epatica attraverso la vena porta nel topo

Published: March 09, 2022
doi:

Summary

Il protocollo descrive un metodo semplice di resezione di un fegato di topo intatto per studi metabolici attraverso la perfusione della vena porta.

Abstract

Le malattie metaboliche come il diabete, il pre-diabete, la steatosi epatica non alcolica (NAFLD) e la steatoepatite non alcolica (NASH) stanno diventando sempre più comuni. Le perfusioni epatiche ex vivo consentono un’analisi completa del metabolismo epatico utilizzando la risonanza magnetica nucleare (NMR), in condizioni nutrizionali che possono essere rigorosamente controllate. Poiché le simulazioni in silico rimangono un mezzo principalmente teorico per valutare le azioni ormonali e gli effetti dell’intervento farmaceutico, il fegato perfuso rimane uno dei banchi di prova più preziosi per comprendere il metabolismo epatico. Poiché questi studi guidano le intuizioni di base sulla fisiologia epatica, i risultati devono essere accurati e riproducibili. Il più grande fattore nella riproducibilità della perfusione epatica ex vivo è la qualità della chirurgia. Pertanto, abbiamo introdotto un metodo organizzato e semplificato per eseguire perfusioni epatiche di topo ex vivo nel contesto di esperimenti NMR in situ . Descriviamo anche un’applicazione unica e discutiamo i problemi comuni riscontrati in questi studi. Lo scopo generale è quello di fornire una guida semplice a una tecnica che abbiamo perfezionato nel corso di diversi anni che riteniamo il golden standard per ottenere risultati riproducibili in resezioni epatiche e perfusioni nel contesto di esperimenti NMR in situ . La distanza dal centro del campo per il magnete e l’inaccessibilità del tessuto all’intervento durante l’esperimento NMR rende i nostri metodi nuovi.

Introduction

Le perfusioni ex vivo sono cruciali nello studio del metabolismo epatico e la perfusione attraverso la vena porta è lo standard per questi studi. Per studiare il metabolismo epatico in isolamento, il fegato deve essere resecato dal corpo per evitare complicazioni derivanti dal metabolismo in altri organi (cioè il metabolismo di tutto il corpo) e per esercitare il controllo sulla disponibilità ormonale (insulina, glucagone, ecc.). Questo approccio può essere essenziale per comprendere gli effetti di malattie come il diabete, la NAFLD e la NASH sul metabolismo epatico e sui meccanismi di azione dei farmaci. Questo articolo serve come guida per la resezione epatica e la perfusione. Abbiamo sviluppato una procedura semplificata per eseguire questi studi metabolici sul fegato con sufficiente rigore e riproducibilità. Se l’intervento chirurgico non viene eseguito correttamente, vi è una pronunciata variabilità nei dati metabolici ottenuti. Descriviamo un metodo organizzato per eseguire il cateterismo della vena porta e la resezione epatica nel contesto di studi metabolici in situ in uno spettrometro a risonanza magnetica nucleare (NMR), come descritto nella letteratura 1,2,3,4,5.

Attualmente, non esiste letteratura che descriva una perfusione epatica ex vivo utilizzando una colonna di vetro all’interno di una NMR. Né esiste una pubblicazione video o testuale che fornisca un chiaro esempio di come eseguire la procedura con il fegato di topo, in particolare, dimostrando come cateterizzare la vena porta, resecare un fegato, trasferire e appendere il fegato su una colonna di vetro. Poiché il topo geneticamente modificato è onnipresente per studiare il metabolismo epatico, questa è una procedura essenziale che merita una descrizione completa. Gli interventi chirurgici di perfusione epatica non sono nuovi, ma questo articolo è un metodo gold standard accompagnato da un video che dimostra l’eccellenza tecnica descritta in questo documento per aiutare tutti coloro che sono interessati a questa procedura. Il metodo qui presentato sarebbe meglio applicato al metabolismo in tempo reale per rilevare la funzione e il turnover dei metaboliti nei modelli di malattia.

Questo metodo utilizza una colonna di vetro rivestita d’acqua di 100 cm, che consente al fegato di appendersi sul fondo della cannula incapsulata da perfusate all’interno di un tubo NMR. L’acqua riscaldata nella camicia di vetro viene utilizzata per controllare la temperatura di perfusazione. Un ossigenatore a strato sottile viene pressurizzato con 95%/5% O2/CO2 per il controllo del pH. Utilizzando tre pompe separate, viene impostata l’altezza della colonna di perfusato, che fornisce una pressione costante al fegato. Le portate non sono controllate oltre l’applicazione della pressione costante (Figura 1). Per confermare che il fegato funzioni in modo appropriato, vengono effettuate misurazioni dell’ossigeno insieme alle portate. Nelle nostre mani, questo insieme di precondizioni porta a esperimenti NMR altamente ripetibili per la valutazione della funzione metabolica epatica.

Protocol

Gli esperimenti che hanno coinvolto topi sono stati gestiti in conformità con il Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali dell’Università della Florida (numero di protocollo n. 201909320). Il ceppo di topo utilizzato era C57BL/6J; tutti i topi erano maschi. Questo metodo è generalmente applicabile anche per gli studi che utilizzano altri ceppi di topo standard. Questo intervento chirurgico viene eseguito in modo ottimale da due individui che lavorano insieme. 1. Config…

Representative Results

La funzionalità epatica è valutata principalmente dal consumo di ossigeno e dalla portata. Una portata di 4-8 ml/min e un consumo di ossigeno di 1 μmol/min.g sono tipici. Queste misure varieranno a seconda delle specifiche condizioni sperimentali e delle differenze biologiche. La quantità esatta di isoflurano utilizzata dipenderà dal tipo di sistema di anestesia utilizzato, nonché dall’ambiente e dall’età/peso del mouse. Durante l’intervento chirurgico, l’isoflurano e il gas di mandata …

Discussion

Questa procedura chirurgica è impegnativa e richiede una pratica approfondita per ottenere risultati riproducibili. L’isoflurano e il gas di trasporto devono essere regolati secondo necessità per mantenere la vitalità dell’animale attraverso la maggior parte della procedura chirurgica possibile. L’ambiente, l’ora del giorno, l’età, il peso e molti altri fattori influenzeranno l’anestesia. Il peso, la dieta, il ceppo dei topi e l’età potrebbero influenzare la chirurgia poiché l’accumulo di grasso può interferire co…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del National Institutes of Health (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Una parte di questo lavoro è stata eseguita nel McKnight Brain Institute presso la National High Magnetic Field Laboratory’s Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy (AMRIS) Facility, che è supportata dal National Science Foundation Cooperative Agreement No. DMR-1644779 e lo Stato della Florida.

Materials

1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe N/A N/A Non-specific Brand
100 cm Water Jacketed Glass Column N/A N/A Custom Made
2-0 Silk Suture Braintree Scientific N/A
22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety Terumo SRFF2225
23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles Exel International 26407
27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles Exel International 26426
4×4 in. Surgical Platform N/A N/A Custom Made
70% Alcohol Wipe N/A N/A Non-specific Brand
Circulating Water Bath MS Lauda N/A Model no longer manufactured
Cotton Tip Applicator N/A N/A Non-specific Brand
Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " Roboz RS-6702
Dumont #5/45 Forceps Fine Scientific Tools 11251-35
Dumont #7 – Fine Forceps Fine Scientific Tools 11274-20
Hemostats Fine Scientific Tools 13015-14
Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL RX Generics 71288-0402-02
Isoflurane Patterson Veterinary 14043-0704-06
Lidocaine HCl 2% VEDCO Inc. 50989-0417-12
Membrane-Thin-Layer Oxygenator Radnoti N/A
Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " Roboz RS-6013
Oxygen Meter System Hanstech Instruments Ltd. N/A
Saline 0.9% Solution N/A N/A Saline is made in lab
Scale N/A N/A Non-specific Brand
 Variable Speed Analog Console Pump Systems Cole Palmer N/A Models are custom per application
Weigh boats N/A N/A Non-specific Brand

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Cite This Article
Giacalone, A. G., Merritt, M. E., Ragavan, M. Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse. J. Vis. Exp. (181), e63154, doi:10.3791/63154 (2022).

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