Ex Vivo Perfusion hépatique à travers la veine porte chez la souris
Summary
Le protocole décrit une méthode simple de résection d’un foie de souris intact pour des études métaboliques par perfusion veineuse porte.
Abstract
Les maladies métaboliques telles que le diabète, le prédiabète, la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) et la stéatohépatite non alcoolique (NASH) sont de plus en plus courantes. Les perfusions hépatiques ex vivo permettent une analyse complète du métabolisme hépatique à l’aide de la résonance magnétique nucléaire (RMN), dans des conditions nutritionnelles qui peuvent être rigoureusement contrôlées. Comme les simulations in silico restent un moyen principalement théorique d’évaluer les actions hormonales et les effets de l’intervention pharmaceutique, le foie perfusé reste l’un des bancs d’essai les plus précieux pour comprendre le métabolisme hépatique. Comme ces études guident les connaissances de base sur la physiologie hépatique, les résultats doivent être précis et reproductibles. Le plus grand facteur de reproductibilité de la perfusion hépatique ex vivo est la qualité de la chirurgie. Par conséquent, nous avons introduit une méthode organisée et rationalisée pour effectuer des perfusions hépatiques de souris ex vivo dans le contexte d’expériences de RMN in situ . Nous décrivons également une application unique et discutons des problèmes courants rencontrés dans ces études. L’objectif global est de fournir un guide simple d’une technique que nous avons affinée au cours de plusieurs années et que nous considérons comme la norme d’or pour obtenir des résultats reproductibles dans les résections et perfusions hépatiques dans le cadre d’expériences de RMN in situ . La distance au centre du champ pour l’aimant ainsi que l’inaccessibilité du tissu à l’intervention pendant l’expérience RMN rendent nos méthodes nouvelles.
Introduction
Les perfusions ex vivo sont cruciales dans l’étude du métabolisme hépatique, et la perfusion par la veine porte est la norme pour ces études. Afin d’étudier le métabolisme hépatique isolément, le foie doit être réséqué du corps pour éviter les complications découlant du métabolisme dans d’autres organes (c.-à-d. le métabolisme du corps entier) et pour exercer un contrôle sur la disponibilité des hormones (insuline, glucagon, etc.). Cette approche peut être essentielle pour comprendre les effets de maladies telles que le diabète, la NAFLD et la NASH sur le métabolisme hépatique ainsi que les mécanismes d’action des médicaments. Cet article sert de guide pour la résection hépatique et la perfusion. Nous avons développé une procédure simplifiée pour effectuer ces études métaboliques du foie avec suffisamment de rigueur et de reproductibilité. Si la chirurgie n’est pas effectuée correctement, il existe une variabilité prononcée dans les données métaboliques obtenues. Nous décrivons une méthode organisée pour effectuer un cathétérisme de la veine porte et une résection hépatique dans le cadre d’études métaboliques in situ dans un spectromètre à résonance magnétique nucléaire (RMN), comme décrit dans la littérature 1,2,3,4,5.
Actuellement, il n’existe aucune littérature décrivant une perfusion hépatique ex vivo à l’aide d’une colonne de verre dans une RMN. Il n’y a pas non plus de publication vidéo ou textuelle fournissant un exemple clair de la façon d’effectuer la procédure avec le foie de souris, en particulier, démontrant comment cathétériser la veine porte, réséquer un foie, transférer et accrocher le foie à une colonne de verre. Comme la souris génétiquement modifiée est omniprésente pour étudier le métabolisme hépatique, il s’agit d’une procédure essentielle qui mérite une description complète. Les chirurgies de perfusion hépatique ne sont pas nouvelles, mais cet article est une méthode de référence accompagnée d’une vidéo démontrant l’excellence technique décrite dans cet article pour aider toutes les personnes intéressées par cette procédure. La méthode présentée ici serait mieux appliquée au métabolisme en temps réel pour détecter la fonction et le renouvellement des métabolites dans les modèles de maladie.
Cette méthode utilise une colonne de verre gainée d’eau de 100 cm, qui permet au foie de pendre au fond de la canule encapsulée par du perfusat à l’intérieur d’un tube RMN. L’eau chauffée dans la gaine de verre est utilisée pour contrôler la température du perfusate. Un oxygénateur à couche mince est pressurisé avec 95% / 5% O2 / CO2 pour le contrôle du pH. En utilisant trois pompes séparées, la hauteur de la colonne de perfusat est réglée, ce qui fournit une pression constante au foie. Les débits ne sont pas contrôlés au-delà de l’application d’une pression constante (Figure 1). Pour confirmer que le foie fonctionne correctement, des mesures d’oxygène sont prises avec les débits. Entre nos mains, cet ensemble de conditions préalables conduit à des expériences de RMN hautement reproductibles pour l’évaluation de la fonction métabolique du foie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette intervention chirurgicale est difficile et nécessite une pratique approfondie pour obtenir des résultats reproductibles. L’isoflurane et le gaz porteur doivent être ajustés au besoin pour maintenir la viabilité de l’animal pendant la plus grande partie possible de l’intervention chirurgicale. L’environnement, l’heure de la journée, l’âge, le poids et plusieurs autres facteurs affecteront l’anesthésie. Le poids, l’alimentation, la souche de souris et l’âge pourraient affecter la chirurgie …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par un financement des National Institutes of Health (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Une partie de ce travail a été effectuée au McKnight Brain Institute du National High Magnetic Field Laboratory’s Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy (AMRIS) Facility, qui est soutenu par l’accord de coopération no de la National Science Foundation. DMR-1644779 et l’État de Floride.
Materials
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4×4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
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