Экономичный и эффективный протокол для выделения и культивирования дендритных клеток, полученных из костного мозга, у мышей
Summary
Здесь мы представляем экономичный и эффективный метод выделения и генерации дендритных клеток высокой чистоты костного мозга у мышей после 7 дней культивирования с 10 нг / мл GM-CSF / IL-4.
Abstract
Спрос на дендритные клетки (ДК) постепенно увеличивается по мере продвижения иммунологических исследований. Тем не менее, DC редко встречаются во всех тканях. Традиционный метод выделения ДК в первую очередь включает индуцирование дифференцировки костного мозга (БМ) в ДК путем введения больших доз (>10 нг/мл) гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора/интерлейкина-4 (GM-CSF/IL-4), что делает процедуру сложной и дорогостоящей. В этом протоколе, используя все BM-клетки, культивируемые в среде 10 нг/мл GM-CSF/IL-4, после 3-4 полукультурных обменов, было собрано до 2,7 x 107 клеток CD11c+ (DC) на мышь (две бедренные кости) с чистотой 80%-95%. После 10 дней в культуре экспрессия CD11c, CD80 и MHC II увеличилась, тогда как количество клеток уменьшилось. Количество клеток достигло пика после 7 дней культивирования. Более того, этот метод занял всего 10 минут, чтобы собрать все клетки костного мозга, и большое количество ДК было получено после 1 недели культивирования.
Introduction
Дендритные клетки (DC) являются наиболее мощными антигенпрезентирующими клетками (APC) для активации наивных Т-клеток и индуцирования специфических цитотоксических реакций Т-лимфоцитов (CTL) против инфекционных заболеваний, аллергических заболеваний и опухолевых клеток 1,2,3. ДК являются основным связующим звеном между врожденным иммунитетом и адаптивным иммунитетом и играют важную роль в иммунологической защите и поддержании иммунной толерантности. За последние 40 лет многие исследователи стремились определить подмножества ДК и их функции при воспалении и иммунитете. Согласно этим исследованиям, ДК развиваются вдоль миелоидных и лимфоидных линий из клеток костного мозга. Опухолевые вакцины приобрели значительные вехи в последние годы и имеют многообещающее будущее. Механически опухолевые вакцины модулируют иммунный ответ и предотвращают рост опухоли, активируя цитотоксические Т-лимфоциты с использованием опухолевых антигенов. Вакцина на основе ДК играет важную роль в иммунотерапии опухолей и была идентифицирована как одна из наиболее перспективных противоопухолевых терапий 1,4. Кроме того, ДК широко используются при тестировании новых молекулярно-целевых препаратов и ингибиторов иммунных контрольных точек5.
Исследователям срочно необходимо большое количество РС высокой чистоты для дальнейшего изучения роли РС. Тем не менее, ДК редко встречаются в различных тканях и крови, составляя только 1% клеток крови у людей и животных. Культура in vitro дендритных клеток костного мозга (BMDC) является важным методом получения большого количества клеток DC. Между тем, протокол Лутца для генерации ДК из костного мозга широко используется исследователями6. Хотя протокол эффективен в получении клеток постоянного тока, он является сложным и дорогостоящим, предполагающим добавление высоких концентраций цитокинов и лизис эритроцитов.
В этом исследовании мы сообщаем о методе выделения почти всех клеток костного мозга из костного мозга мыши (BM) и индуцирования дифференцировки в BMDC после 7-9 дней инкубации in vitro с более низкой концентрацией GM-CSF и IL-4. Эта процедура занимает всего 10 минут, чтобы собрать почти все клетки костного мозга и приостановить их в полной среде. Короче говоря, мы предоставляем эффективный и экономичный метод культивирования для BMDC в этом исследовании.
Protocol
Representative Results
Discussion
Люди и мыши имеют различные подмножества постоянного тока, включая классические ДК (кДК, включая cDC1s и cDC2s), плазмоцитоидные ДК (pDC) и моноцитарные ДК (MoDC)9,10,11. Общепризнано, что cDC1s регулируют цитотоксические ответы Т-лимфоцитов (CTL) на внут…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Программой Тяньцзиньского научно-технического плана (20JCQNJC00550), Тяньцзиньским научно-техническим проектом здравоохранения (TJWJ202021QN033 и TJWJ202021QN034).
Materials
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
- Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
- Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
- Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
- Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
- Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
- Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
- Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
- Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
- Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle – An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
- Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).
