פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד וגידול תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכברים
Summary
כאן אנו מציגים שיטה חסכונית ויעילה לבודד וליצור תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם בטוהר גבוה מעכברים לאחר 7 ימים של תרבית עם 10 ננוגרם/מ”ל GM-CSF/IL-4.
Abstract
הביקוש לתאים דנדריטיים (DCs) עולה בהדרגה ככל שהמחקר האימונולוגי מתקדם. עם זאת, DCs הם נדירים בכל הרקמות. השיטה המסורתית לבידוד DCs כוללת בעיקר גרימת התמיינות מח עצם (BM) לתוך DCs על ידי הזרקת מינונים גדולים (>10 ננוגרם/מ”ל) של גורם מגרה מושבה גרנולוציטים-מקרופאגים/אינטרלוקין-4 (GM-CSF/IL-4), מה שהופך את ההליך למורכב ויקר. בפרוטוקול זה, באמצעות כל תאי ה-BM בתרבית במדיום GM-CSF/IL-4 של 10 ng/mL, לאחר חילופי חצי-תרבית של 3-4, נקטפו עד 2.7 x 107 תאי CD11c+ (DCs) לכל עכבר (שני עצם הירך) בטוהר של 80%-95%. לאחר 10 ימים בתרבית, הביטוי של CD11c, CD80 ו- MHC II גדל, בעוד שמספר התאים ירד. מספר התאים הגיע לשיאו לאחר 7 ימים של תרבית. יתר על כן, שיטה זו לקחה רק 10 דקות כדי לקצור את כל תאי מח העצם, ומספר גבוה של DCs הושגו לאחר שבוע אחד של תרבית.
Introduction
תאים דנדריטיים (DCs) הם התאים החזקים ביותר המציגים אנטיגן (APCs) להפעלת תאי T נאיביים ולגרימת תגובות ספציפיות של לימפוציטים ציטוטוקסיים T (CTL) נגד מחלות זיהומיות, מחלות אלרגיה ותאי גידול 1,2,3. DCs הם החוליה העיקרית בין חסינות מולדת לחסינות מסתגלת וממלאים תפקיד חיוני בהגנה החיסונית ובשמירה על סבילות חיסונית. ב-40 השנים האחרונות, חוקרים רבים ביקשו להגדיר את תת-הקבוצות של DCs ואת תפקידיהן בדלקת ובחסינות. על פי מחקרים אלה, DCs מתפתחים לאורך השושלות המיאלואידיות והלימפואידיות מתאי מח העצם. חיסוני הגידולים זכו לאבני דרך משמעותיות בשנים האחרונות ויש להם עתיד מבטיח. מבחינה מכנית, חיסונים נגד גידולים מווסתים את התגובה החיסונית ומונעים את צמיחת הגידול על ידי הפעלת לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T באמצעות אנטיגנים סרטניים. החיסון המבוסס על DCs ממלא תפקיד חשוב באימונותרפיה של הגידול וזוהה כאחד הטיפולים המבטיחים ביותר נגד גידולים 1,4. בנוסף, נעשה שימוש נרחב ב-DCs בבדיקות של תרופות חדשות ממוקדות מולקולרית ומעכבי מחסום חיסוני5.
חוקרים זקוקים בדחיפות למספר גבוה של DCs בעלי טוהר גבוה כדי להמשיך ולחקור את תפקידם של DCs. עם זאת, DCs הם נדירים ברקמות שונות ובדם, ומהווים רק 1% מתאי הדם בבני אדם ובבעלי חיים. תרבית במבחנה של תאים דנדריטיים של מח עצם (BMDC) היא שיטה חשובה להשגת כמויות גדולות של תאי DC. בינתיים, פרוטוקול לוץ להפקת DCs ממח עצם נמצא בשימוש נרחב על ידי חוקרים6. למרות שהפרוטוקול יעיל בהשגת תאי DC, הוא מורכב ויקר, וכולל תוספת של ריכוזים גבוהים של ציטוקינים ואת התזה של תאי הדם האדומים.
במחקר זה אנו מדווחים על שיטה לבידוד כמעט כל תאי מח העצם ממח העצם ממח העצם של העכבר (BM) ולגרימת התמיינות ל-BMDC לאחר 7-9 ימים של דגירה במבחנה, עם ריכוז נמוך יותר של GM-CSF ו-IL-4. הליך זה לוקח רק 10 דקות כדי לקצור כמעט את כל תאי מח העצם ולהשעות אותם במדיום שלם. בקצרה, אנו מספקים שיטת תרבות יעילה וחסכונית עבור BMDC במחקר זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
לבני אדם ולעכברים יש תת-קבוצות DC שונות, כולל DCs קלאסיים (cDCs, כולל cDC1s ו-cDC2s), DCs (pDCs) פלזמציטואידים (pDCs) ו-DCs שמקורם במונוציטים (MoDCs) 9,10,11. מקובל לחשוב ש-cDC1s מווסתים תגובות לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T (CTL) לפתוגנים תוך-תאיים ולסרטן, ו-cDC2s מווסתים את…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של טיאנג’ין (20JCQNJC00550), פרויקט המדע והטכנולוגיה של טיינג’ין לבריאות (TJWJ20202021QN033 ו- TJWJ202021QN034).
Materials
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
- Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
- Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
- Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
- Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
- Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
- Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
- Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
- Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
- Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle – An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
- Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).
