Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos
Summary
Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.
Abstract
A demanda por células dendríticas (DCs) está aumentando gradualmente à medida que a pesquisa em imunologia avança. No entanto, os DCs são raros em todos os tecidos. O método tradicional de isolação de DCs envolve principalmente induzir a diferenciação de medula óssea (MT) em DCs, injetando grandes doses (>10 ng/mL) de fator estimulante da colônia granulocito-macrófago/interleucina-4 (GM-CSF/IL-4), tornando o procedimento complexo e caro. Neste protocolo, utilizando todas as células BM cultivadas em 10 ng/mL GM-CSF/IL-4, após 3-4 trocas de meia cultura, até 2,7 x 107 células CD11c+ (DCs) por rato (dois fêmures) foram colhidas com uma pureza de 80%-95%. Após 10 dias na cultura, a expressão de CD11c, CD80 e MHC II aumentou, enquanto o número de células diminuiu. O número de células atingiu o pico após 7 dias de cultura. Além disso, este método levou apenas 10 minutos para colher todas as células de medula óssea, e um alto número de DCs foram obtidos após 1 semana de cultura.
Introduction
As células dendríticas (DCs) são as células mais poderosas que apresentam antígeno (APCs) para ativar células T ingênuas e induzir respostas específicas de linfócitos T citotóxicos específicos (CTL) contra doenças infecciosas, doenças alérgicas e células tumorais 1,2,3. Os DCs são o principal elo entre imunidade inata e imunidade adaptativa e desempenham um papel essencial na defesa imunológica e na manutenção da tolerância imunológica. Nos últimos 40 anos, muitos pesquisadores têm procurado definir os subconjuntos dos DCs e suas funções em inflamação e imunidade. De acordo com esses estudos, os DCs desenvolvem-se ao longo das linhagens mieloide e linfoides a partir de células de medula óssea. As vacinas tumorais ganharam marcos significativos nos últimos anos e têm um futuro promissor. Mecanicamente, as vacinas tumorais modulam a resposta imune e previnem o crescimento do tumor ativando linfócitos T citotóxicos usando antígenos tumorais. A vacina baseada em DCs desempenha um papel importante na imunoterapia tumoral e foi identificada como uma das terapias anti-tumores mais promissoras 1,4. Além disso, os DCs têm sido amplamente utilizados nos testes de novas drogas de alvo molecular e inibidores de ponto de verificação imunológico5.
Os pesquisadores precisam urgentemente de um alto número de DCs de alta pureza para estudar melhor o papel dos DCs. No entanto, os DCs são raros em vários tecidos e sangue, representando apenas 1% das células sanguíneas em humanos e animais. A cultura in vitro de células dendríticas de medula óssea (BMDC) é um método importante para a obtenção de grandes quantidades de células DC. Enquanto isso, o protocolo Lutz para geração de DCs a partir da medula óssea tem sido amplamente utilizado pelos pesquisadores6. Embora o protocolo seja eficaz na obtenção de células DC, é complexo e caro, envolvendo a adição de altas concentrações de citocinas e a lise dos glóbulos vermelhos.
Neste estudo, relatamos um método para isolar quase todas as células de medula óssea da medula óssea do camundongo (MMO) e induzir a diferenciação em BMDC após 7-9 dias de incubação in vitro, com menor concentração de GM-CSF e IL-4. Este procedimento leva apenas 10 minutos para colher quase todas as células de medula óssea e suspendê-las em um meio completo. Em suma, fornecemos um método de cultivo eficiente e econômico para o BMDC nesta pesquisa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Humanos e camundongos têm diferentes subconjuntos dc, incluindo DCs clássicos (cDCs, incluindo cDC1s e cDC2s) DCs plasmacitóides (pDCs) e DCs derivados de monócitos (MoDCs)9,10,11. É geralmente aceito que os cDC1s regulam as respostas citotóxicas de Linfocito T (CTL) a patógenos intracelulares e câncer, e os cDC2s regulam respostas imunes a patógenos extracelulares, parasitas e alérgenos12. Um n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Programa do Plano de Ciência e Tecnologia de Tianjin (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 e TJWJ202021QN034).
Materials
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
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