Summary

제노푸스 라레비스 배아의 블라스코클로로 분비된 성장 인자 변형 분석 가족 분열 제품

Published: July 21, 2021
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Summary

성장 인자 ß 를 변형할 때 가족 전구체 단백질은 제노푸스 라예비스 배아에서 ectopically 발현될 때, 그들은 분화하고, 갈라지고, 초기 가스트루라 단계로 늦은 블라술라에서 시작되는 blastocoele로 분비됩니다. 우리는 면역 blot 분석을 위한 blastocoele 캐비티에서 분열 제품을 심는 방법을 설명합니다.

Abstract

Tgfß/Nodal 또는 뼈 형태유전학 단백질(Bmp) 리간드로 표현되는 변형 성장 인자 ß(Tgfß) 슈퍼 패밀리의 두 팔은 배아 발달과 성인 항상성에서 필수적인 역할을 합니다. Tgfß 가족의 구성원은 내시경 망상 내에서 이산화 하고 접는 비활성 전구체로 만들어집니다. 전구체는 이어서 리간드 및 프로도메인 조각으로 갈라진다. 비록 디메라 리간드만 Tgfß 수용체를 참여시키고 다운스트림 신호링을 활성화할 수 있지만, 프로도메인 모이티가 리간드 활동에 기여한다는 인식이 증가하고 있습니다. 이 문서에서는 Tgfß 전구체 단백질의 활성화 중에 생성된 분열 제품을 식별하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 설명합니다. Tgfß 전구체를 코딩하는 RNA는 X. laevis 배아로 처음으로 마이크로 주입됩니다. 다음 날, 분열 제품은 가스트룰라 단계 배아의 blastocoele에서 수집되고 서양 얼룩에서 분석됩니다. 이 프로토콜은 비교적 빨리 완료 될 수 있으며 고가의 시약을 필요로하지 않으며 생리적 조건하에서 농축 된 Tgfß 분열 제품의 원천을 제공합니다.

Introduction

변형 성장 인자 ß (Tgfß) 슈퍼 패밀리의 구성원은 비활성, 이질 전구체 단백질로 합성된다. 전구체는 그 때 분비 통로 내 또는 세포의 외부proprotein 변환기 (PC) 가족의 일원에 의해 갈라지는 것입니다. 이렇게 하면 활성 이황화물 결합 리간드 디머와 두 개의 프로도메인 조각1이생성됩니다. 30년 이상 알려져 왔지만 Tgfß 가족 전구체의 프로도메인이 활성 리간드2를생성하는 데 필요하며, 프로도메인이 리간드 기능에 어떻게 기여하는지에 대한 이해는 불완전합니다.

Tgfß 가족 구성원의 프로테오리틱 활성화 과정에 대한 이해는 불완전하지만, 특정 세포 외 또는 세포 외 구획에서분열이 발생하는지 여부, 그리고 프로 도메인이 크리브 리간드3와공유 또는 비일관성으로 연관되어 있는지 여부에 대한 이해에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 여러 연구는 프로 도메인이 분열4,5전에 리간드 접이식을 안내 할뿐만 아니라, 또한 성장 인자 안정성과 작용의 범위에 영향을 미칠 수 있음을 보여 주었다6,7,8,9,호모이머 또는 이성애자의 형성을 구동10,리간드 대기 시간을 유지하기 위해 세포 외 매트릭스에 리간드 를 고정11,어떤 경우에는, 자신의 오른쪽에 리그간드로 역할을 신호12. Tgfß 가족의 많은 구성원의 프로 도메인 내에서 이종점 돌연변이는 눈, 뼈, 신장, 골격 또는인간3의다른 결함과 관련이 있다. 이 사실 인정은 활성 리간드를 생성하고 유지하는 데 있어 프로도메인의 중요한 역할을 강조하고 Tgfß 가족 전구체의 프로테오리틱 성숙 중에 개발 된 분열 제품의 역할을 식별하고 해독하는 것의 중요성을 강조합니다.

여기에서 우리는 X. laevis 배아의 blastocoele에서 Tgfß 가족 선구자의 성숙 도중 생성된 분열 제품을 심는 다음 면역 blot에 그(것)들을 분석하기 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 전구체 단백질에서 하나 이상의 PC 컨센서스 모티프가 생체10,13에서갈라졌는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있으며, 각 모티프(13)를 갈라지는 내인성 PC(들)를 식별할 수있다.,14,Tgfß 가족 homodimers의 생체 형성에서 이성애자(10)를 비교하거나 Tgfß 전구체에서 인간 질병 관련 포인트 돌연변이가 기능성 디메릭 리간드를 형성하는 능력에 영향을 미치는지 여부를 분석한다.

Protocol

설명된 모든 절차는 유타 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받습니다. 개구리는 IACUC 승인 시설에 보관됩니다. 수컷 개구리는 심장의 심실을 클리핑하여 트리카인에 침수하여 안락사됩니다. 암컷 개구리는 달걀 수집을 허용하기 위해 산란의 호르몬 유도다음 최대 24 시간 동안 실험실에 보관된 다음 치료 시설로 돌아갑니다. 1. X. laevis 고의 컬렉션</…

Representative Results

아래에 설명된 실험의 목표는 Bmp4와 Bmp7 형태 이성구(Bmp4 리간드 1개와 Bmp7 리간드 1개로 구성된 디머), 호모디머(Bmp4 또는 2개의 Bmp7 리간드로 구성됨) 또는 X. laevis에서 공동 발현될 때 각각의 혼합물을 결정하는 것이었습니다. 도 2에 표시된 데이터는 이전에 게시된 연구10에서추출된다. 도 2A는 Bmp4 또는 Bmp7 균질 전구체 또는 Bmp4/…

Discussion

여기에 설명된 프로토콜의 주요 장점은 비교적 빨리 완료될 수 있고, 고가의 시약을 필요로 하지 않으며, 생리학적 조건 하에서 농축 된 Tgfß 분열 제품의 원천을 제공한다는 것이다. 또 다른 장점은 에피토프 태그 단백질을 분석하고 따라서 대부분의 Tgfß 가족 prodomain을 인식하는 상업적으로 이용 가능한 항체의 부족을 우회할 수 있다는 것입니다. 또한 전감염된 배양 포유류 세포에서 에피토프 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 훌륭한 동물 관리에 대한 메리 산체스 감사합니다. 저자의 연구는 국립 보건 원 (NIH /NICHD)의 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소 (NIH /NICHD)에 의해 지원됩니다 R01HD067473-08 및 R21 HD102668-01 및 당뇨병 과 소화 및 신장 질환의 국립 연구소에 의해 (NIDDK/NIH) R01DK1208.08.

Materials

ß-mercaptoethanol Fisher AC125470100
Bromophenol Blue Fisher B392-5
Calcium Chloride Fisher C79-500
Calcium Nitrate Fisher C109-500
Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder Fisher 12-141-364
Dumont #5 forceps Fine Science tools 11251-10
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
Ficoll 400 Sigma Aldrich F9378-500G
Glass capillary, 1 X 90 mm Narshige G-1
Glycerol Fisher G33-4
HEPES Fisher BP310-500
Human chorionic gonadotropin Sigma Aldrich CG10-10VL
Injection Syringe, 1 mL Fisher 8881501368
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
Magnesium Sulfate Fisher M63-500
Needle, 26 G Fisher 305111
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140148
Picoliter Microinjector Warner Instruments PLI-100A
Pipette Puller Narashige PC-100
Potassium Chloride Fisher P217-500
PVDF Membrane Sigma Aldrich IPVH00010
Sodium Bicarbonate Fisher S233-500
Sodium Chloride Fisher S271-10
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide Fisher S318-500
Tricaine-S Pentair TRS5
Tris Fisher BP152-5

References

  1. Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
  2. Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor–beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
  3. Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
  4. Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. Structure and activation of pro-activin A. Nature Communications. 7, 12052 (2016).
  5. Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
  6. Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
  7. Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
  8. Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
  9. Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
  10. Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
  11. Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
  12. Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332 (2020).
  13. Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
  14. Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
  15. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
  16. Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. Proprotein convertase genes in Xenopus development. Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).
  17. Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
  18. Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
  19. Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. . Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).
  20. Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
  21. Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).

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Cite This Article
Kim, H., Christian, J. L. Analysis of Transforming Growth Factor ß Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (173), e62782, doi:10.3791/62782 (2021).

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