Summary

Analisi dei prodotti di scissione della famiglia Transforming Growth Factor ß secreti nel blastocoelo di embrioni di Xenopus laevis

Published: July 21, 2021
doi:

Summary

Quando le proteine precursori della famiglia Transforming Growth Factor ß sono espresse ectopicamente negli embrioni di Xenopus laevis, si dimerizzano, si scindono e vengono secrete nel blastocoele, che inizia nella blastula tardiva fino allo stadio iniziale di gastrula. Descriviamo un metodo per aspirare i prodotti di scissione dalla cavità del blastocoele per l’analisi immunoblot.

Abstract

I due bracci della superfamiglia del fattore di crescita trasformante ß (Tgfß), rappresentati rispettivamente dai ligandi Tgfß/nodali o della proteina morfogenetica ossea (Bmp), svolgono ruoli essenziali nello sviluppo embrionale e nell’omeostasi adulta. I membri della famiglia Tgfß sono fatti come precursori inattivi che dimerizzano e si piegano all’interno del reticolo endoplasmatico. Il precursore viene successivamente scisso in frammenti di ligando e prodominio. Sebbene solo il ligando dimerico possa coinvolgere i recettori Tgfß e attivare la segnalazione a valle, vi è un crescente riconoscimento che la parte del prodominio contribuisce all’attività del ligando. Questo articolo descrive un protocollo che può essere utilizzato per identificare i prodotti di scissione generati durante l’attivazione delle proteine precursori di Tgfß. L’RNA che codifica per i precursori di Tgfß viene prima microiniettato negli embrioni di X. laevis. Il giorno seguente, i prodotti di scissione vengono raccolti dal blastocoele degli embrioni allo stadio di gastrula e analizzati su macchie occidentali. Questo protocollo può essere completato in tempi relativamente brevi, non richiede reagenti costosi e fornisce una fonte di prodotti concentrati di scissione Tgfß in condizioni fisiologiche.

Introduction

I membri della superfamiglia Del fattore di crescita trasformante ß (Tgfß) sono sintetizzati come proteine precursori inattive e dimerizzate. I precursori vengono quindi scissi dai membri della famiglia della proproteina convertasi (PC), sia all’interno della via secretoria che al di fuori delle cellule. Questo crea un dimero di ligando attivo legato al disolfuro e due frammenti di prodominio1. Sebbene sia noto da oltre 30 anni che il prodominio dei precursori della famiglia Tgfß è necessario per generare un ligandoattivo 2, la comprensione di come i prodomini contribuiscono alla funzione del ligando è incompleta.

Sebbene la comprensione del processo di attivazione proteolitica dei membri della famiglia Tgfß rimanga incompleta, vi è un crescente interesse nel capire quali motivi di consenso PC sono scissi in vivo, se la scissione si verifica in uno specifico compartimento subcellulare o extracellulare e se il prodominio rimane covalentemente o non covalentemente associato al ligando scisso3. Diversi studi hanno dimostrato che il prodominio non solo guida il ripiegamento del ligandoprima della scissione4,5,ma può anche influenzare la stabilità del fattore di crescita e il raggio d’azione6,7,8,9,guidare la formazione di omodimeri o eterodimeri10,ancorare il ligando nella matrice extracellulare per mantenere la latenza del ligando11e, in alcuni casi, funzionare come un ligando a sé stante per attivare eterologo segnalazione12. Le mutazioni puntiformi eterozigoti all’interno del prodominio di molti membri della famiglia Tgfß sono associate a difetti oculari, ossei, renali, scheletrici o di altro tiponell’uomo 3. Questi risultati evidenziano il ruolo critico del prodominio nella generazione e nel mantenimento di un ligando attivo e sottolineano l’importanza di identificare e decifrare il ruolo dei prodotti di scissione sviluppati durante la maturazione proteolitica dei precursori della famiglia Tgfß.

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per aspirare i prodotti di scissione generati durante la maturazione dei precursori della famiglia Tgfß dal blastocoele degli embrioni di X. laevis e poi analizzarli su immunoblot. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare se uno o più motivi di consenso PC in una proteina precursore sono scissi in vivo10,13, identificare i PC endogeni che scissono ciascunmotivo 13,14, confrontare la formazione in vivo di omodimeri della famiglia Tgfß rispetto agli eterodimeri10 o analizzare se le mutazioni puntiformi associate alla malattia umana nei precursori di Tgfß influenzano la loro capacità di formare ligandi dimerici funzionali.

Protocol

Tutte le procedure descritte sono approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell’Università dello Utah. Le rane sono ospitate in una struttura approvata dalla IACUC. Le rane maschio vengono eutanasizzate mediante immersione nella tricaina che segue tagliando il ventricolo del cuore. Le rane femmine sono ospitate in laboratorio per un massimo di 24 ore dopo l’induzione ormonale della deposizione delle uova per consentire la raccolta delle uova e quindi restituite alla struttura di cura. <p cl…

Representative Results

L’obiettivo dell’esperimento descritto di seguito era determinare se Bmp4 e Bmp7 formano eterodimeri (dimeri composti da un ligando Bmp4 e un ligando Bmp7), omodimeri (composti da due ligandi Bmp4 o due Bmp7) o una miscela di ciascuno quando sono co-espressi in X. laevis. I dati mostrati nella Figura 2 sono estratti da uno studio precedentemente pubblicato10. La Figura 2A è uno schema che mostra i prodotti di scissione generati …

Discussion

I principali vantaggi del protocollo qui descritto sono che può essere completato in tempi relativamente brevi, non richiede reagenti costosi e fornisce una fonte di prodotti concentrati di scissione Tgfß in condizioni fisiologiche. Un altro vantaggio è che consente di analizzare le proteine marcate con epitopi e quindi aggirare la carenza di anticorpi disponibili in commercio che riconoscono la maggior parte del prodominio della famiglia Tgfß. Sebbene sia anche possibile analizzare la scissione delle proteine precur…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Mary Sanchez per l’eccellente cura degli animali. La ricerca degli autori è sostenuta dal National Institute of Child Health and Human Development del National Institutes of Health (NIH / NICHD) sovvenzioni R01HD067473-08 e R21 HD102668-01 e dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK / NIH) grant R01DK128068-01.

Materials

ß-mercaptoethanol Fisher AC125470100
Bromophenol Blue Fisher B392-5
Calcium Chloride Fisher C79-500
Calcium Nitrate Fisher C109-500
Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder Fisher 12-141-364
Dumont #5 forceps Fine Science tools 11251-10
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
Ficoll 400 Sigma Aldrich F9378-500G
Glass capillary, 1 X 90 mm Narshige G-1
Glycerol Fisher G33-4
HEPES Fisher BP310-500
Human chorionic gonadotropin Sigma Aldrich CG10-10VL
Injection Syringe, 1 mL Fisher 8881501368
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
Magnesium Sulfate Fisher M63-500
Needle, 26 G Fisher 305111
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140148
Picoliter Microinjector Warner Instruments PLI-100A
Pipette Puller Narashige PC-100
Potassium Chloride Fisher P217-500
PVDF Membrane Sigma Aldrich IPVH00010
Sodium Bicarbonate Fisher S233-500
Sodium Chloride Fisher S271-10
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide Fisher S318-500
Tricaine-S Pentair TRS5
Tris Fisher BP152-5

References

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Cite This Article
Kim, H., Christian, J. L. Analysis of Transforming Growth Factor ß Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (173), e62782, doi:10.3791/62782 (2021).

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