Summary

تحليل تحويل عامل النمو ß منتجات الانقسام الأسرة تفرز في Blastocoele من الأجنة Xenopus laevis

Published: July 21, 2021
doi:

Summary

عند تحويل عامل النمو ß البروتينات السلائف الأسرة يتم التعبير عنها خارج الرحم في الأجنة Laevis Xenopus، فإنها تغمغم، والحصول على مشقوق وتفرز في blastocoele، الذي يبدأ في وقت متأخر blastula إلى مرحلة gastrula في وقت مبكر. نحن نصف طريقة لاستنشق منتجات الانقسام من تجويف الانفجار لتحليل المناعة.

Abstract

الذراعين من عامل النمو تحويل ß (Tgfß) superfamily، ممثلة Tgfß / العقدة أو العظام البروتين المورفوجيني (Bmp) ليغاندس، على التوالي، تلعب أدوارا أساسية في التنمية الجنينية وهوس العظام الكبار. يتم إجراء أعضاء الأسرة Tgfß والسلائف غير نشطة أن تتناقص وأضعاف داخل الشبكية endoplasmic. يتم شق السلائف في وقت لاحق إلى شظايا ليغاند وبروتدومين. على الرغم من أن فقط ليغاند ثنائية يمكن إشراك مستقبلات Tgfß وتفعيل الإشارات المصب، وهناك اعتراف متزايد بأن moiety prodomain يساهم في النشاط ليغاند. توضح هذه المقالة بروتوكول يمكن استخدامه لتحديد منتجات الانقسام التي تم إنشاؤها أثناء تنشيط بروتينات السلائف Tgfß. يتم أولا حقن سلائف ترميز RNA Tgfß في أجنة X. laevis. في اليوم التالي ، يتم جمع منتجات الانقسام من blastocoele من أجنة مرحلة gastrula وتحليلها على البقع الغربية. يمكن إكمال هذا البروتوكول بسرعة نسبيا، لا يتطلب الكواشف باهظة الثمن ويوفر مصدرا للمنتجات الانقسام Tgfß المركزة في ظل ظروف فسيولوجية.

Introduction

يتم تصنيع أعضاء عامل النمو التحويلي ß (Tgfß) بشكل فائق كبروتينات سلائف غير نشطة وخافتة. ثم يتم شق السلائف من قبل أعضاء عائلة تحويل البربروتين (PC) ، إما داخل المسار الافرازي أو خارج الخلايا. وهذا يخلق نشطة، disulfide المستعبدين ليغند ديمر واثنين من شظايا prodomain1. على الرغم من أنه كان معروفا لأكثر من 30 عاما أن مطلوب من السلائف الأسرة Tgfß لتوليد ليغاند نشط2, فهم كيفية prodomains المساهمة في وظيفة ليغاند غير مكتملة.

على الرغم من أن فهم عملية التنشيط البروتيوليكي لأفراد عائلة Tgfß لا يزال غير مكتمل ، إلا أن هناك اهتماما متزايدا بفهم أي عزر توافق PC (ق) مشقوق في الجسم الحي، وما إذا كان الانقسام يحدث في مقصورة فرعية أو خارج الخلية محددة ، وما إذا كان المجال الأساسي لا يزال مرتبطا بشكل متناقض أو غير متناقض مع الليغندالمشقوق 3. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن prodomain ليس فقط أدلة ليغاند للطي قبل الانقسام4,5, ولكن يمكن أيضا التأثير على استقرار عامل النمو ومجموعة من العمل6,7,8,9, محرك تشكيل homodimers أو heterodimers10, مرساة ليغاند في مصفوفة خارج الخلية للحفاظ على الكمون ليغاند11, وفي بعض الحالات, وظيفة باعتبارها ليغاند في حد ذاتها لتنشيط heterologous إشارة12. وترتبط الطفرات نقطة Heterozygous داخل نطاق العديد من أفراد الأسرة Tgfß مع العين والعظام والكلى والهيكل العظمي أو غيرها من العيوب في البشر3. تسلط هذه النتائج الضوء على الدور الحاسم للبروتودمين في توليد والحفاظ على ليغاند نشط وتشدد على أهمية تحديد وفك شفرة دور منتجات الانقسام التي تم تطويرها أثناء النضج البروتيوليكي للسلائف العائلية Tgfß.

هنا نصف بروتوكول مفصل لمنتجات شق القرصنة المتولدة أثناء نضوج السلائف الأسرة Tgfß من blastocoele من الأجنة X. laevis ومن ثم تحليلها على الخلايا المناعية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد ما إذا كان واحد أو أكثر من عزر توافق الآراء PC (ق) في بروتين السلائف هي مشقوق في الجسم الحي10،13، وتحديد PC الذاتية (ق) التي تلتصق كل عزر13،1 14، قارن في تشكيل الجسم الحي من المثليات الأسرة Tgfß مقابل heterodimers10 أو تحليل ما إذا كانت الطفرات نقطة المرتبطة بالأمراض البشرية في السلائف Tgfß تؤثر على قدرتها على تشكيل ليغاندس ثنائية الأبعاد وظيفية.

Protocol

جميع الإجراءات المذكورة معتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) في جامعة يوتا. يتم إيواء الضفادع في منشأة معتمدة من IACUC. يتم قتل الضفادع الذكور عن طريق الانغماس في tricaine التالية عن طريق قص البطين من القلب. يتم إيواء الضفادع الإناث في المختبر لمدة أقصاها 24 ساعة بعد التعري?…

Representative Results

كان هدف التجربة الموصوف أدناه هو تحديد ما إذا كان Bmp4 و Bmp7 يشكلان heterodimers (dimers يتكون من Bmp4 ligand واحد و Bmp7 ligand) ، homodimers (يتكون من Bmp4 أو اثنين من Bmp7 ligands) ، أو مزيج من كل عندما يتم التعبير عنها في X. laevis. يتم استخراج البيانات المعروضة في الشكل 2 من دراسة نشرت سابقا10. <str…

Discussion

المزايا الرئيسية للبروتوكول الموصوف هنا هي أنه يمكن إكماله بسرعة نسبية ، ولا يتطلب كاشفات باهظة الثمن ويوفر مصدرا لمنتجات شق Tgfß المركزة في ظل ظروف فسيولوجية. ميزة أخرى هي أنه يسمح للمرء بتحليل البروتينات الموسومة epitope وبالتالي التحايل على نقص الأجسام المضادة المتاحة تجاريا التي تعترف مع…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر ماري سانشيز على العناية الممتازة بالحيوانات. ويدعم أبحاث المؤلفين المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH/NICHD) منح R01HD067473-08 وR21 HD102668-01 والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK/NIH) منحة R01DK128068-01.

Materials

ß-mercaptoethanol Fisher AC125470100
Bromophenol Blue Fisher B392-5
Calcium Chloride Fisher C79-500
Calcium Nitrate Fisher C109-500
Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder Fisher 12-141-364
Dumont #5 forceps Fine Science tools 11251-10
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
Ficoll 400 Sigma Aldrich F9378-500G
Glass capillary, 1 X 90 mm Narshige G-1
Glycerol Fisher G33-4
HEPES Fisher BP310-500
Human chorionic gonadotropin Sigma Aldrich CG10-10VL
Injection Syringe, 1 mL Fisher 8881501368
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
Magnesium Sulfate Fisher M63-500
Needle, 26 G Fisher 305111
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140148
Picoliter Microinjector Warner Instruments PLI-100A
Pipette Puller Narashige PC-100
Potassium Chloride Fisher P217-500
PVDF Membrane Sigma Aldrich IPVH00010
Sodium Bicarbonate Fisher S233-500
Sodium Chloride Fisher S271-10
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide Fisher S318-500
Tricaine-S Pentair TRS5
Tris Fisher BP152-5

References

  1. Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
  2. Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor–beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
  3. Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
  4. Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. Structure and activation of pro-activin A. Nature Communications. 7, 12052 (2016).
  5. Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
  6. Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
  7. Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
  8. Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
  9. Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
  10. Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
  11. Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
  12. Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332 (2020).
  13. Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
  14. Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
  15. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
  16. Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. Proprotein convertase genes in Xenopus development. Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).
  17. Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
  18. Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
  19. Sopory, S., Christian, J. L., Whitman, M. A., Whitman, S. . Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. , 38-55 (2006).
  20. Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
  21. Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).

Play Video

Cite This Article
Kim, H., Christian, J. L. Analysis of Transforming Growth Factor ß Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (173), e62782, doi:10.3791/62782 (2021).

View Video